CT联合血清SMRP早期诊断大鼠恶性胸膜间皮瘤的研究

江杰，谢晓洁，吴莉，赵雯，赵迅冉，韩丹

恶性胸膜间皮瘤(malignant pleural mesothelioma，MPM)是来源于浆膜间皮细胞的少见恶性肿瘤，接触石棉及相关制品是MPM的主要病因[1-2]。MPM早期常无任何临床症状及体征，发现时多处于肿瘤中晚期，严重影响患者生存质量及预后，如何早期筛查高危人群、诊断MPM是业界研究的热点[3]。CT检查是MPM诊断及鉴别诊断的首选方法，本课题组前期研究发现CT诊断早期MPM(直径小于1 cm的结节，特别是小于0.3 cm的结节或小而薄的斑片状胸膜增厚)容易漏诊，即使能发现，也无法通过形态学与其他病变鉴别[4-5]。由此启迪我们有必要寻找或结合其它简单易行的实验室指标与CT影像学进行综合分析，提高MPM早期诊断及鉴别诊断率。查阅文献发现，间皮素在胸膜间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌中存在高表达，但缺乏特异性，在诊断早期MPM中值得挖掘[6-10]。但MPM发病率低，临床病例搜集困难、影响因素太多，难以动态观察MPM变化，单纯基于临床病例的研究无法深入，因此本研究采用MPM动物模型来弥补上述不足。本研究首次创新性提出将高分辨率CT检查与血清可溶性间皮素相关蛋白(soluble mesothelin-related protein，SMRP)检测联合起来诊断早期MPM，为具有石棉暴露史的高危人群筛查、早期诊断MPM提供实验依据及理论基础。

材料与方法

1.MPM肿瘤诱导

SD大鼠100只，雌雄各50只，体重120～150 g，购自昆明医科大学动物实验中心，许可证编号 SYXK( 滇) K2015-0002。采用右侧胸腔闭式注射青石棉纤维混悬液诱发大鼠MPM[4]。共获得MPM大鼠72例，其中上皮型21例(29.2%)，肉瘤型37例(51.4%)，混合型14例(19.4%)；肺癌4例，死亡4例，未出现肿瘤20例。根据国际肺癌研究协会(IASLC)2018年关于MPM诊疗指南进行TNM病理分期[11]：T1期12例，T2期22例，T3期30例，T4期8例；N0期 49例，N1期 15例，N2期8例；M0期65例，M1期7例。

2.SMRP测定

抽取大鼠尾静脉血1 mL，采用ELISA法测定血清SMRP浓度，检测试剂盒及标准品购自上海酶联生物科技有限公司。分析不同分期MPM的SMRP表达情况。

3.CT检查及图像分析

采用Philips 128层Ingenuity CT，肿瘤诱发后第3个月开始对大鼠行胸腹部平扫及增强扫描。扫描参数：管电压100 kV，管电流100 mAs，准直器64×0.625 mm，螺距0.992，旋转时间0.5 s，层厚1.0 mm，层间距0.5 mm。对比剂采用碘普罗胺注射液(370 mg I/mL)经尾静脉注射，流率0.2 mL/s，总量3 mL。记录CT分期[12]：早期，病变局限在胸膜腔内。中期：侵犯胸膜以外组织，包括胸壁、肺及纵隔组织；晚期，通过膈肌侵犯腹腔或侵犯对侧胸膜及远处转移。与病理分期进行比较，分析CT诊断不同分期MPM的价值。

4.统计学分析

采用SPSS 21.0统计学软件包。计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验或方差分析，两两比较采用LSD检验。采用受试者操作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲线分析CT、SMRP对MPM各分期的诊断效能。采用Delong检验比较CT联合SMRP和单独CT诊断MPM的ROC曲线下面积(area under curve，AUC)的差异。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1.CT对MPM诊断情况

72例大鼠MPM，CT诊断MPM 50例(69.4%)，诊断非MPM 5例(6.9%)，未发现病变17例(23.7%)。CT诊断MPM 分期，T1期5例(35.7%)，T2期13例(52.2%)，T3期25例(89.3%)，T4期7例(100%)。CT诊断MPM的AUC为0.65，敏感度为64.5%，特异度为71.2%；T分期诊断的AUC为0.85，敏感度、特异度分别为53.5%、61.6%；N分期诊断的AUC为0.82，敏感度、特异度分别为72.5%、75%；M分期诊断的AUC为0.85，敏感度、特异度分别为100.0%、95.0%。对T1、T2期诊断的AUC为0.55，敏感度为41.3%，特异度为53%；对T3、T4期诊断的AUC为0.83，敏感度为87.5%，特异度为89.3%(表1)。对T1、T2期诊断效能较差，对T3、T4期诊断效能较高，对N、M分期诊断效能较高。

表1 CT对MPM分期的诊断效能

2.不同分期MPM的血清SMRP表达差异

不同T分期、不同N分期、不同M分期的MPM血清SMRP表达差异均具有统计学意义(F值分别为539.55、32.41，t值为5.67，P均<0.05，表2)，随着分期增高，SMRP表达量增。

表2 MPM不同分期SMRP表达量差异比较

3.SMRP对MPM的诊断价值

SMRP对MPM 不同T分期、N分期、M分期诊断效能见表3。SMRP诊断T1期MPM的ROC曲线AUC为0.83，最佳临界值是1.90 mmol/mL，敏感度为100%，特异度为88.2%；SMRP诊断T2期MPM的ROC曲线AUC为0.86，最佳临界值是4.53 mmol/mL，敏感度为100%，特异度为85.7%；SMRP诊断T3期MPM的ROC曲线AUC为0.92，最佳临界值是8.73 mmol/mL，敏感度为71.4%，特异度为100%；SMRP诊断T4期MPM的 ROC曲线AUC为0.85，最佳临界值是11.97 mmol/mL，敏感度为87.5%，特异度为100%。SMRP诊断N0期MPM的 ROC曲线AUC为0.59，敏感度为100%，特异度为100%；SMRP诊断N1期MPM的ROC曲线AUC为0.84，敏感度为47.1%，特异度为100%；SMRP诊断N2期MPM的ROC曲线AUC为0.92，敏感度为64%，特异度为100%。SMRP诊断M1期MPM的ROC曲线AUC为0.88，敏感度为75%，特异度为100% (表3)。

表3 SMRP对不同MPM分期的诊断价值

4.CT联合SMRP早期诊断MPM的价值

CT分期联合SMRP对诊断MPM的价值分析(表4，图1～3)，对T分期，ROC曲线AUC为0.97，敏感度为90.5%，特异度为92.5%，明显高于CT诊断MPM(AUC为0.85，敏感度为53.5%，特异度为61.6%)。对N分期，ROC曲线AUC为0.96，敏感度为87.5%，特异度为92.5%，明显高于CT诊断(AUC为0.82，敏感度为72.5%，特异度为75%)。对M分期，ROC曲线AUC为0.95，敏感度为100%，特异度为98%，高于CT诊断MPM(AUC为0.85，敏感度为100%，特异度为95%)。

表4 CT联合SMRP对不同MPM分期的诊断效能

讨 论

CT作为首选检查在MPM诊断及鉴别诊断、肿瘤分期、肿瘤治疗疗效及预后评估等具有重要作用[13-14]。对进展期MPM诊断并不困难，但对诊断早期MPM局限较大，CT表现为阴性，不能完全排外MPM。本研究中72例MPM，CT仅发现50例，T1期5例(35.7%)，T2期13例(52.2%)，T3期25例(89.3%)，T4期7例(100%)，说明CT检查对不同T分期MPM诊断价值不同，越早期越容易漏诊。通过CT分期与病理分期比较分析得出CT对T1、2期诊断效能较差，对T3、4期诊断效能较高。分期越高，CT准确度越高。说明CT检查早期诊断价值并不高，这与文献报道类似[15-16]。以往研究报道CT对MPM诊断敏感度、特异度分别约68%、57%[15]，本研究研究对T1、T2期诊断低于文献报道的结果。但也证实了CT检查对早期诊断MPM有一定限制。此外研究[16]显示CT会低估MPM分期，将肿瘤分期延迟，CT对多达80%的处于1期和2期、23%的3期MPM分期存在错误，对N分期准确率仅为50%。对于N期、M期CT检查准确率较高，N期反映的是淋巴结转移情况、M期反映是否存在远处转移，CT检查对存在淋巴结转移、远处转移价值大，存在转移情况下一般都属于T3、T4期。MPM分期直接关系着患者预后、生活质量及生存率，分期显得尤为重要。说明临床实践以CT分期作为标准可能导致不恰当的治疗方式的选择及预后评估；对于中晚期的MPM患者治疗效果欠佳，预后极差，此时对患者来说临床意义不大。说明影像学检查手段对于MPM早期来说确实很难，影像学发现会滞后病变发展情况，那对于高危人群来说就会错过早期发现、早期诊断、早期治疗的最佳时机。因此对于CT无法诊断、甚至无法发现的早期MPM病例，如何提高早期诊断率显得尤为重要，这是业界努力的方向及研究的目标。

图1 雄鼠，诱发后第8个月。a、b)分别为肺窗和纵隔窗，显示双侧肺尖胸膜、纵隔胸膜增厚(箭)，诊断为早期MPM；c)病理诊断为上皮型MPM。SMRP表达量为8.3mmol/mL，提示为中期MPM。

提示处于早期，但CT未见异常；3个月后SMRP为7.8mmol/mL，说明病变进展，此时CT显示胸膜病变。

随着分子生物技术的发展，可能为早期诊断MPM提供新的视角，其中间皮素是目前研究最广泛的MPM生物标记物之一，也是唯一一种由美国食品和药物管理局批准用于MPM诊断的以血液为基础的生物标记物，但是研究较少且存在很多问题[17]。本研究分析不同TNM分期的SMRP表达差异具有统计学意义，分期越高，SMRP表达量越高。淋巴结转移N0、N1、N2期SMRP表达量差异具有统计学意义，进一步两两比较N1、N2差异不具统计学意义。是否具有远处转移M0、M1期表达量差异同样具有统计学意义。结果提示SMRP可反映肿瘤分期，可推测可能参与了肿瘤发生发展、迁移转移等过程。本研究还分析了对应T分期的每一期SMRP表达量，提供了一个量化指标，为具有石棉暴露史的高危人群检测血清SMRP表达来早期发现MPM提供了理论依据。研究分析[17]MPM与其他非MPM组的间皮素表达情况及对预后的观察，发现在MPM组，血清、血浆间皮素存在高表达，以3.5 ng/mL作为临界值判断生存预后，发现>3.5 ng/mL的MPM患者生存中位时间明显缩短(7个月)低于血清中<3.5 ng/mL的MPM患者(19个月)，提示间皮素对判断MPM预后有价值；并且认为间皮素是独立预后因子，价值高于肿瘤分期。此外研究[18]表明SMRP可用于检测恶性间皮瘤进展的肿瘤标志物和评估肿瘤的治疗反应，但其敏感性较低(35%～50%)。另外本研究发现在CT表现为阴性的病例中，同样发现SMRP表达阳性，随着时间推移，SMRP浓度逐渐升高，说明SMRP对早期诊断MPM有一定价值，可先于影像学检查出现异常，也表明SMRP表达对石棉暴露者可能发展为MPM有一定提示价值，这与文献报道一致[19]。Hollevoet等[20]在一项meta分析中发现在石棉暴露史的高危人群中高灵敏度阈值下SMRP表达为阴性也不能完全排外MPM的存在，相反在高特异性阈值下，SMRP表达阳性有助于早期诊断MPM，但假阳性率低、特异度高。对具有石棉暴露史的高危人群出现SMRP高表达提示可能出现MPM，在SMRP表达正常的人群中，MPM出现率是很低的，但也无法完全排除，具有较高阴性预测率，灵敏度较低。

图3 雌鼠，诱发后第7个月。a)肺窗显示右肺上叶少许渗出；b)纵隔窗显示双上背侧胸膜稍增厚(箭)；c)增强CT，胸膜未见明显肿块，CT诊断双肺上叶炎症、胸膜炎性改变；d)病理诊断为上皮型MPM。SMRP表达量为3.74 mmol/mL，提示为早期MPM。

SMRP定量检测对早期诊断MPM有一定价值，但SMRP可在多种肿瘤中表达，不具特异性，利用CT检查对胸膜病变的高特异性，两者联合起来对早期诊断具有重要价值。因此本研究分析CT检查联合SMRP检测对早期诊断MPM的价值，研究发现对T分期，两者联合诊断明显高于单用CT检查。说明两者联合诊断MPM可明显提高诊断敏感性、特异性。对具有石棉暴露史的高危人群检测血清中的SMRP简单易行，如果发现SMRP表达出现高表达，提示可能出现MPM，再利用CT检查高分辨率检查，可随访胸膜病变，排外胰腺、卵巢等肿瘤，对临床早期发现MPM具有重要实践意义。当然本研究还存在一些问题，由于是动物实验，结果尚不能直接用于临床实践；发现SMRP可能与肿瘤发生发展、转移等过程有关，但未对具体机制进行研究。这些问题将在本课题系列研究中继续开展。

综上所述， CT检查联合SMRP对早期诊断MPM具有可行性，能明显提高MPM的早期诊断效能，可为具有石棉暴露史的高危人群筛查、早期诊断MPM提供理论依据和实验基础。