黄杨碱诱导胶质母细胞瘤细胞T98G 凋亡及对其自噬的影响*

张 琳，傅若秋，段冬玉，李紫薇，陈剑鸿

（中国人民解放军陆军军医大学大坪医院药剂科，重庆 400042）

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，占所有颅内肿瘤的40% ～50%[1]。世界卫生组织（WHO）将胶质母细胞瘤（GBM）列为Ⅳ级[2]。GBM 患者中位生存期约为18 个月，30%的患者生存期为2年，达到5年生存期的患者低于7%[3-5]。目前，对于GBM 的标准疗法为手术切除联合放射治疗，并采用替莫唑胺辅以化学治疗（简称化疗）[6-7]。标准疗法尽管在一定程度上延长了患者的生存时间，但预后仍不乐观，主要原因为GBM 对化疗药物产生了严重耐药性，最终导致治疗失败[8-9]。故寻找一种新型抗胶质瘤药物是目前亟须解决的问题。黄杨碱（CVBD）是小叶黄杨及其同属植物中提取的生物碱，最初用于治疗心律失常等疾病[10]。有研究表明，CVBD对乳腺癌、肝癌、结直肠癌等细胞具有抑制作用[11-13]，但目前尚无抗GBM 作用及机制研究的报道。本研究中探讨了CVBD 抗GBM 细胞T98G（简称T98G 细胞）活性的初步机制，发现CVBD 可能通过Akt/mTOR/ERK信号通路诱导了T98G 细胞的凋亡，并阻碍了其自噬降解过程，为将CVBD 进一步开发成新型抗胶质瘤药物提供理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

1.1.1 仪器

HR30-11A2 型生物安全柜（青岛海尔股份有限公司）；3111 型CO2细胞培养箱（美 国Thermo 公司）；CKX41 型光学倒置显微镜（日本Olympus 公司）；EVOSF1 型荧光显微镜（美国Thermo 公司）；GS-15K型高速冷冻离心机（美国Beckman 公司）；STNERGY H1型酶标仪（美国Agilent 公司）；C6 型流式细胞仪（美国BD 公司）；165-8001 型蛋白电泳仪、转膜槽、Chem I Doc 型超高灵敏度化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.1.2 试药

CVBD（成都曼思特生物科技有限公司，批号为MUST-18081102，纯度≥99%）。DMEM 高糖培养基（美国Hyclone 公司，批号为SH30022.01）；胎牛血清（天津康源生物技术有限公司，批号为20180918）；胰酶消化液（批号为C0201），western 细胞裂解液（批号为P0031），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（增强型，批号为P0009），均购自上海碧云天生物技术有限公司；预染蛋白（美国Thermo 公司，批号为26619）；cleaved-Caspase 3（C- Caspase 3，批号为19677-1-AP），PARP（批号为13371-1-AP），均购自美国Proteintech 公司；GADPH（美国Cell Signaling Technology 公司，批号为2118S）；phospho-Akt（P-Akt，美国CST 公司，批号为4060S）；phospho-ERK（P-ERK，批 号 为ab50011），phosphomTOR （P-mTOR，批 号 为ab137133），ERK（批 号 为ab17942），Akt（批 号 为 ab200195），mTOR（批 号 为ab2723），均购自美国Abcam 公司；LC3Ⅱ（美国Sigma 公司，批号为L7543）及辣根酶标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号为ZB2305）；Bafilomycin A1（批号为HY-00558）及CCK-8 试剂盒（美国MCE公司）；细胞凋亡检测试剂盒（美国BD 公司，批号为556547）；Rapamycin（美国Selleck Chemicals 公司，批号为S1039）。

1.1.3 细胞

胶质母细胞瘤细胞T98G 源于美国菌种保藏中心（ATCC）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

T98G 细胞用含有10% 胎牛血清的DMEM 高糖培养基在适宜湿度、37 ℃及5% CO2条件下恒温培养，隔1 d换液，待细胞汇合率达90%时用胰酶消化进行传代，取对数期生长细胞进行后续试验。试验分为对照组（0 μmol/L）和CVBD1，2，3，4 组（40，80，120，160 μmol/L）。同法培养T98G 细胞24 h。

1.2.2 细胞存活率的检测

将T98G 细胞以5×103个/孔的密度接种于96 孔板，37 ℃及5% CO2条件下培养24 h，按1.2.1 项下方法处理细胞。每孔加入10 μL CCK-8 工作液，恒温孵育2 h，于450 nm 波长处检测吸光度，并计算细胞存活率。

1.2.3 细胞凋亡率的检测

T98G 细胞以2×105个/孔的密度接种于6 孔板，37 ℃及5% CO2条件下培养24 h，按1.2.1 项下方法处理细胞。去除培养基，取1 mL PBS 漂洗1 遍后加500 μL胰酶消化液，轻柔吹打，混匀，转移至离心管，800 r/min离心5 min。去除上清液，PBS 清洗2 遍，800 r/min 离心5 min。用Annexin V-FITC/PI 双染色，即将2 μL PI 与5 μL FITC 和100 μL binding buffer 混匀，并轻柔重悬细胞团，室温避光处染色15 min。用流式细胞仪检测T98G细胞凋亡情况，并计算凋亡率。

1.2.4 蛋白表达水平

T98G 细胞以1.5×106个/皿的密度接种于100 mm细胞培养皿，37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，按1.2.1 项下方法处理细胞。提取T98G 全细胞蛋白，用BCA 法测定蛋白含量。每组加入5×loading buffer 涡旋混匀，96 ℃金属浴，使蛋白变性得蛋白样品。每组取15 μg 上样，在电压为60 ～120 V 条件下，进行聚丙烯凝胶电泳（SDSPAGE）90 min。恒电流300 mA 转膜150 min 至PVDF膜上，5%脱脂奶粉常温封闭2 h，TBST 漂洗，4 ℃孵育目标抗体至过夜。次日回收一抗，TBST 漂洗，在室温下孵育相应二抗2 h。TBST 漂洗后用凝胶成像系统进行曝光。将条带灰度值数字化，目的条带与内参条带灰度比值为各目的蛋白表达水平。

1.2.5 细胞自噬情况

T98G 细胞以2×104个/孔的密度接种于24 孔板，37 ℃及5% CO2条件下培养24 h。试验分为对照组（A 组，0 μmol/L）及CVBD 组（B 组，120 μmol/L）、Bafilomycin A1 组（C 组，20 nmol/L）、Rapamycin 组（D 组，0.25 μmol/L）。以Lipofectamine 3000 转染tfLC3 质粒。取2 支1.5 mL 离心管，先分别加入25 μL Opti-MEM，其后，1 支加入0.75 μL Lipofectamine 3000，另1 支加入500 ng tfLC3 质粒和1 μL P3000 试剂，充分混匀。将2 支离心管的内容物混匀，室温孵育5 min，形成质粒-脂质体混合物。将质粒-脂质体混合物加入细胞中，每孔50 μL，振摇，混匀，37 ℃、5% CO2条件下培养12 h，换液，24 h 后分组，同1.2.1 项下方法处理细胞。

1.2.6 统计学处理

采用SPSS19.0统计学软件分析。计量资料以表示，行单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖情况

与对照组比较，CVBD 1 组、2 组、3 组、4 组的细胞存活率随着CVBD 浓度的增加而逐渐降低，且呈量效依赖趋势（P＜0.05）。详见表1。

2.2 细胞凋亡情况

与对照组比较，CVBD 1 组、2 组、3 组、4 组的细胞凋亡率随着CVBD 浓度的增加而逐渐升高，且呈量效依赖趋势（P＜0.05）。详见表1 和图1。

表1 各组T98G 细胞存活率和凋亡率比较（±s，n=3）Tab.1 Comparison of viability rate and apoptosis rate of T98G cells in each group（±s，n=3）

表1 各组T98G 细胞存活率和凋亡率比较（±s，n=3）Tab.1 Comparison of viability rate and apoptosis rate of T98G cells in each group（±s，n=3）

注：与对照组比较，*P ＜0.05。表2 同。Note：Compared with those in the control group，*P ＜0.05，as well as Tab.2.

组别对照组黄杨碱1 组黄杨碱2 组黄杨碱3 组黄杨碱4 组浓度（μmol/L）04080120160细胞存活率（%）100.0059.62±3.94*49.46±3.34*47.92±2.57*41.49±3.66*细胞凋亡率（%）3.86±0.5215.64±0.69*38.37±1.32*44.16±1.42*49.93±2.34*

图1 T98G 细胞凋亡情况Fig.1 The apoptosis of T98G cells

2.3 细胞凋亡相关蛋白表达情况

与 对 照 组 比 较，CVBD 1 组、2 组、3 组、4 组cleaved-PARP（C-PARP）和C-Caspase3 蛋 白 表 达水平显著升高（P＜0.05）。详见表2 和图2。

表2 各组细胞凋亡、信号通路及自噬相关蛋白表达水平比较（±s，n=3）Tab.2 Comparison of the expression levels of apoptosis，signaling pathway and autophagy related-proteins of cells in each group（±s，n=3）

表2 各组细胞凋亡、信号通路及自噬相关蛋白表达水平比较（±s，n=3）Tab.2 Comparison of the expression levels of apoptosis，signaling pathway and autophagy related-proteins of cells in each group（±s，n=3）

组别对照组黄杨碱1 组黄杨碱2 组黄杨碱3 组黄杨碱4 组浓度（μmol/L）04080120160 C-PARP/PARP 0.263±0.0960.400±0.055*1.005±0.135*2.663±0.396*3.326±0.538*C-Caspase 3/GAPDH 0.017±0.0030.129±0.025*0.913±0.078*1.069±0.120*1.308±0.099*P-Akt/Akt 0.636±0.0400.626±0.0290.645±0.0530.292±0.035*0.181±0.012*P-mTOR/mTOR 0.968±0.0400.972±0.0070.698±0.078*0.400±0.033*0.320±0.014*P-ERK/ERK 1.163±0.1351.113±0.1680.493±0.157*0.263±0.029*0.235±0.013*LC3Ⅱ/GAPDH 0.452±0.1291.015±0.092*1.131±0.041*1.172±0.016*1.287±0.042*

图2 T98G 细胞凋亡相关蛋白表达情况Fig.2 The expression of apoptosis-related proteins of T98G cells

2.4 信号通路相关蛋白表达情况

与对照组比较，CVBD 2 组、3 组、4 组的P-mTOR和P-ERK 蛋白表达水平及CVBD 3 组、4 组的P-Akt蛋白表达水平均显著降低。详见表2 和图3。

2.5 细胞自噬情况

与对照组比较，CVBD 1 组、2 组、3 组、4 组的LC3Ⅱ蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。详见表2 和图4 A。通过荧光显微镜观察荧光团发现，CVBD 与Bafilomycin A1 分别作用于T98G 细胞后均只观察到黄色荧光点，而Rapamycin 作用于T98G 细胞后能观察到较多的红色荧光点。详见图4 B。

3 讨论

CVBD 最初用于治疗心律失常等疾病[10]。近年来，越来越多的研究揭示了CVBD 新的药理学效应，如抗肿瘤活性。研究表明，CVBD 对乳腺癌、肝癌、结直肠癌及胃癌肿瘤细胞有一定抑制作用，可通过抑制细胞增殖、阻碍细胞侵袭、引起线粒体损伤、诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤效应[11-14]。

PARP 即聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，是一类影响细胞生物学过程的蛋白质超家族，在DNA 修复、基因组稳定性和细胞程序性死亡中发挥着重要作用[15]。PARP 还是细胞凋亡核心成员半胱天冬酶（Caspase）的切割底物，发生凋亡时，Caspase 信号通路被激活，启动Caspase依赖的细胞内源性凋亡途径，而PARP 的降解和Caspase3 的激活被认为是细胞发生凋亡的标志性事件[16]。本研究结果显示，CVBD 可抑制T98G 细胞增殖和诱导其凋亡，且呈浓度依赖趋势。此外，CVBD 还可激活凋亡相关蛋白PARP 的降解，升高C-PARP 和C-Caspase3蛋白表达水平，也呈浓度依赖趋势，表明CVBD 通过激活Caspase3 凋亡信号通路诱导T98G 细胞发生凋亡。

图3 信号通路相关蛋白表达情况Fig.3 The expression of signaling pathway related-proteins of T98G cells

图4 T98G 细胞自噬情况A.Expression of LC3 Ⅱprotein B.Fluorescence microscopyFig.4 Autophagy of T98G cells

Akt/mTOR 信号通路在调节多种肿瘤细胞的增殖和凋亡方面起着关键作用。有研究表明，Akt/mTOR 信号通路的过度激活可使肿瘤细胞存活[17]。FENG 等[18]发现，通过下调P-AKT 和P-mTOR 可诱导甲状腺癌细胞凋亡。本研究结果显示，CVBD 可降低P-Akt 和P-mTOR蛋白表达水平，提示CVBD 可能通过Akt/mTOR 信号通路诱导T98G 细胞发生凋亡。ERK 属丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，它的激活与促进肿瘤细胞增殖密切相关，而磷酸化的ERK 可上调下游致癌激酶和转录因子的表达，从而促进肿瘤细胞存活、生长和侵袭[19]。有研究显示，金丝桃素可通过降低ERK 磷酸化水平诱导胶质瘤细胞凋亡[20]。LIN 等[21]研究发现，黄芩素可通过抑制ERK 激活，阻滞骨肉瘤细胞周期和抑制侵袭，最终导致其凋亡。本研究结果显示，CVBD 可降低ERK 磷酸化水平，提示可能通过抑制ERK 通路抑制T98G 细胞增殖，并诱导其凋亡。此外，Akt/mTOR 信号通路还与自噬密切相关，AKT 是一种丝氨酸苏氨酸激酶，位于PI3K下游，在Ⅰ型PI3K 作用下可形成P-AKT，mTOR 是PI3K/Akt 下游的一种重要蛋白激酶，与细胞增殖、侵袭、凋亡密切相关，同时也是调控自噬的重要因子[22-23]。本研究结果表明，CVBD 可降低P-Akt 和P-mTOR 的表达水平，说明CVBD 诱导的细胞凋亡可能与自噬有关。

自噬是细胞的一个生物学过程，细胞内部的待降解底物由双层膜包裹后形成自噬小体，然后和溶酶体融合形成自噬溶酶体，待降解物经过溶酶体酸性环境被水解后，回到细胞质再循环利用[24]。如果自噬过程被阻断，自噬小体无法与溶酶体结合，那么自噬小体将会过度堆积，导致细胞自噬性死亡[25]。有研究显示，CVBD 可通过激活自噬诱导乳腺癌细胞凋亡[12]。但仅通过LC3Ⅱ水平升高就推断是诱导自噬显然是不够的。本研究运用了检测自噬流的“金标准”，即转染tfLC3 双光质粒，结果表明，CVBD 可升高自噬标志蛋白LC3Ⅱ的表达水平，同时转染tfLC3 质粒后可引起T98G 细胞内产生黄色荧光团，以上结果证实CVBD 阻断了自噬降解过程。然而阻断自噬的原因有多种，CVBD 阻断细胞自噬降解的机制还有待进一步研究。

综上所述，CVBD 可抑制T98G 细胞增殖，并诱导其凋亡，作用机制可能是通过Akt/mTOR/ERK 信号通路激活了Caspase 凋亡途径且阻碍了T98G 细胞的自噬降解过程，最终导致T98G 细胞凋亡。