黄豆苷元对不同基因型健康受试者氯沙坦药代动力学的影响*

肖昌琼，陈 锐

（湖南省郴州市第一人民医院中心医院药学部临床药学科，湖南 郴州 423000）

植物雌激素是具有弱雌激素作用的杂环多酚类化合物，广泛存在于多种物质中，如蔬菜、豆类、水果等，尤其是亚麻籽、三叶草及豆制品中。植物性雌激素主要包括异黄酮、香豆雌酚和木脂素三大类。植物雌激素具有抗增生、诱导细胞凋亡、抗氧化、增强免疫力等多种生物活性[1-3]，故其在性激素依赖性肿瘤的防治方面备受关注[4]。黄豆苷元是具有较强雌激素活性的植物激素，能扩张冠状动脉、脑动脉、股动脉，增强脑血流量和四肢血液循环，减弱血管阻力，降低血液黏度，减少心肌耗氧量，改善心功能，增加末梢血流量，改变血液流变学，并具有改善心律及降压作用，临床多用于高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）、脑血栓、突发性耳聋、眩晕症等的辅助治疗，也可用于妇女更年期综合征的治疗。氯沙坦是选择性血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，临床广泛用于高血压和心力衰竭的治疗[5]。氯沙坦在体内主要由CYP2C9 代谢为羧酸代谢产物E-3174，二者共同作用可阻断血管紧张素Ⅱ的生理作用，从而发挥降压作用[6]。CYP2C9*2 和CYP2C9*3 可降低白种人体内氯沙坦的代谢水平[7]，故携带CYP2C9 突变等位基因的个体可能会出现代谢减慢或降低，从而发生药物中毒或降低药物疗效。在中国人群中，除了野生型CYP2C9*1，已发现的最主要的基因型为CYP2C9*3，频率约为3.3% 。本研究中探讨了黄豆苷元对不同CYP2C9 基因型健康受试者氯沙坦及其代谢产物E-3174 药代动力学的影响。现报道如下。

1 仪器、试药与研究对象

1.1 仪器

T1 型聚合酶链式反应（PCR）仪（德国Biometra 公司）；QuattroMicro API 型串联四极杆液质联用仪，包括Waters 2695 型高效液相色谱仪、温控自动进样器、温控柱温箱、电喷雾离子化源（ESI）及MassLynx 4.0 数据处理系统（美国Waters 公司）；KL512 型氮吹仪（北京康林科技有限责任公司）。

1.2 试药

黄豆苷元片（河南中孚药业有限公司，批号为151209）；氯沙坦片（浙江杭州默沙东药业有限公司，批号为T034534）；氯沙坦钾对照品（批号为100597-201703，纯 度 为99.7% ），E-3174 对 照 品（批 号 为2001116，纯度为99.5%），均购于美国Sigma-Aldrich公司；引物（上海博亚生物技术有限公司）；DNA marker、内切酶、T4DNA 连接酶、LA Taq 酶、dNTP（宝生物工程＜大连＞有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，华美生物工程有限公司）；普通琼脂糖（美国Bio-Rad 公司）；乙腈、甲醇均为色谱纯，其余试剂均为国产分析纯，水为重蒸水。

1.3 研究对象

将医院数据库中200 名健康志愿者以限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）法进行CYP2C9基因分型。选取志愿者前臂外周静脉取外周血，离心、分离血浆，抽提DNA，分离不同长度DNA 片段。

CYP2C9*3 基 因 分 型：上 游5′-TGCACGAGGTCCAGAGGTAC-3′，下游5′-ACAAACTTACCTTGGGAATGAGA-3′；反应总体积为25 μL。PCR 条件，98 ℃预变性30 s，96 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，78 ℃延伸30 s，循环34 次；74 ℃10 min，4 ℃5 min 终止反应。扩增产物15 μL 与10 mol/L Buffer 2 μL 及Kpn 内切酶1 μL混合，37 ℃水浴4 h，酶切产物在3%琼脂糖凝胶上电泳观察DNA 片段。

CYP2C9*13 基 因 分 型：上 游5′-TACAAATACAATGAAAATATCA-3′ ，下 游 5′-CTAACAACCAGACTCATAATG-3′，反应总体积为25 μL。PCR 条件，96 ℃预变性30 s，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循环34 次；延伸70 ℃10 min，4 ℃5 min 终止反应。扩增产物10 μL 与10 mol/L NEB 2 μL、10×BSA 0.2 μL、BstnⅠ内切酶混合，37 ℃水浴4 h，酶切产物在3%琼脂糖凝胶上电泳观察DNA 片段。

筛选出18 例男性受试者（对照组和试验组），包括CYP2C9*1/*1、CYP2C9*1/*3 与CYP2C9*1/*13基因型各6 例（3 个亚组），年龄（20.5±1.9）岁，身高（165.3±2.6）cm，体质量（56.6±5.9）kg；身体健康，既往无肝肾疾病、出血性疾病、心脑血管疾病、神经系统疾病、血液系统疾病史；无药物过敏史，无吸烟、饮酒史。本试验方案经医院医学伦理委员会批准，受试者知情同意。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备及血浆样品提取、处理

对照品溶液制备：1）氯沙坦对照品溶液。取氯沙坦钾对照品5.91 mg，精密称定，置25 mL 容量瓶中，加甲醇-水（50 ∶50，V/ V）溶解定容，得217 μg/mL 氯沙坦对照品贮备液；用空白血浆稀释成氯沙坦质量浓度为1085，543，217，109，54，22，11，5，2.2，1.1，0.5 ng/mL的系列对照品溶液。2）E-3174 对照品溶液。称取5.0 mg E-3174 对照品，置25 mL 容量瓶中，加甲醇-水（50 ∶50，V/ V）溶解定容，摇匀，得质量浓度为200 μg/mL 的E-3174 贮备液；用空白血浆稀释成E-3174 质量浓度为1000，500，200，100，50，20，10，5，2，1，0.5 ng/mL 的系列对照品溶液。均置4 ℃贮藏，备用。

血浆样品提取：本试验按双周期、自身前后对照方案进行，第一阶段随机分为对照组和试验组，受试者分别口服黄豆苷元片或安慰剂15 d，第15 天两组受试者均口服氯沙坦50 mg；经过14 d 洗脱期后交叉重复试验。均分别于口服氯沙坦后0，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，12 h 时采集静脉血5 mL，置含乙二胺四乙酸（EDTA）的玻璃试管中，-20 ℃贮藏，备用。

血浆样品处理：取200 μL 血浆样品，置15 mL 玻璃离心管中，加入250 μL 0.5%甲酸溶液，混匀，加入2 mL 甲基叔丁基醚（MTBE），涡旋振荡3 min，4000 r/min离心12 min，-40 ℃冷冻35 min，取上清液1.5 mL，置另一离心管中；40 ℃下、水浴氮气挥干，加入200 μL 流动相，振荡，溶解，即得。

2.2 血药浓度测定方法建立

色谱条件：色谱柱为ThermoHypurity C18柱（150mm×2.1 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液（60 ∶40，V/ V），流速为0.2 mL/min，柱温为41 ℃，自动进样瓶温为20 ℃。

质谱条件：采用ESI 正离子多反应模式检测，正负离子同时检测，全扫描模式，毛细管电压为3.6 kV，取样锥孔电压30V，萃取锥孔电压3V，ESI 源温为100℃，去溶剂温度为350 ℃，锥孔气体流速为50 L/h，去溶剂气体流速为350 L/h。氯沙坦检测离子为m/ z423.2→m/ z405.1，207.1，192.1，氩气碰撞能量分别为10，20，25 eV；E-3174 检测离子为m/ z437.1→m/ z235.2，207.2，氩气碰撞能量分别为20，25 eV。

适用性试验：按选定试验条件进样测定，记录质谱。结果氯沙坦和E-3174 的保留时间分别为2.45 min 和2.78 min，各峰峰形对称，血浆中杂质在与氯沙坦和E-3174 对照品相同保留时间处无干扰峰，详见图1。氯沙坦和E-3174 最低检出浓度分别为1.5，2.5 ng/mL。

线性关系考察：分别精密量取2.1 项下系列对照品溶液，按选定试验条件进样测定，记录离子响应强度。以氯沙坦、E-3174 质量浓度（X，ng/mL）为横坐标、离子响应强度（Y）为纵坐标进行线性回归，得氯沙坦、E-3174 回归方程分别为Y氯=0.0874641X氯+0.0852054，YE=0.0271464XE+0.0637231（r均为0.9999）。结果表明，氯沙坦、E- 3174 质量浓度分别在2.2 ～1085.0 ng/mL，2.0 ～1000.0 ng/mL 范围内与离子响应强度线性关系良好。

精密度试验：取2.1 项下氯沙坦、E-3174 对照品溶液适量，按选定试验条件连续进样测定6 次，记录离子响应强度。结果氯沙坦、E-3174 离子响应强度的RSD均小于15%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.1 项下血浆样品溶液适量，反复冻融，按选定试验条件连续进样测定6 次，记录离子响应强度，结果5，54，543 ng/mL 氯沙坦和5，50，500 ng/mL E-3174 离子响应强度的RSD均低于15%。于-40 ℃下放置30 d，按选定试验条件连续进样测定6 次，记录离子响应强度，结果RSD分别在6.8% ～13.6% 和7.2% ～12.9%范围内，均符合化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则要求。

加样回收试验：取已知含量的血浆样品适量，共6 份，分别加入一定质量浓度的氯沙坦、E-3174 对照品溶液，同法制备血浆样品溶液，再按选定试验条件进样测定，记录离子响应强度，并计算回收率。结果见表1。

图1 高效液相色谱质谱图A.Blank plasma B.Blank plasma+losartan control C.Blank plasma+E-3174 control D.Losartan in plasma samples after administration E.E-3174 in plasma samples after administrationFig.1 HPLC-MS chromatograms

2.3 药代动力学分析

药代动力学参数采用非房室模型分析，采用高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS）法检测氯沙坦血药浓度，测定血浆浓度和达峰时间；采用梯形法计算药时曲线下面积（AUC），得峰浓度（Cmax）和达峰时间（tmax）；将对数化（自然对数）的浓度-时间曲线消除相各点按最小二乘法原理进行线性回归，得直线的斜率即为清除率常数（Ke），清除半衰期（t1/2）按公式t1/2=0.693/Ke计算。采用SPSS 11.0 统计学软件分析，计量资料以表示，行one-way ANOVA 分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。对照组中，与CYP2C9*1/*1 亚组比较，CYP2C9*1/*3 亚组和CYP2C9*1/*13 亚组受试者血浆E-3174 的Cmax显著降低（P＜0.05）；试验组中，3 亚组受试者血浆E-3174 的Cmax无显著差异（P＞0.05）。试验组和对照组3 个亚组受试者血浆氯沙坦的Cmax无显著差异（P＞0.05）。与对照组比较，试验组CYP2C9*1/*1基因型受试者血浆E-3174 的Cmax显著降低（P＜0.05）。详见表2、图2、图3 和表3。

表1 加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of recovery tests（n=6）

表2 两组受试者血浆样品中氯沙坦药代动力学参数比较（±s，n=6）Tab.2 Comparison of pharmacokinetic parameters of losartan in plasma samples of volunteers in the two groups（±s，n=6）

表2 两组受试者血浆样品中氯沙坦药代动力学参数比较（±s，n=6）Tab.2 Comparison of pharmacokinetic parameters of losartan in plasma samples of volunteers in the two groups（±s，n=6）

指标AUC0→12（ng·h/mL）Cmax（ng/mL）tmax（h）t1/2（h）基因型CYP2C9*1/*1 CYP2C9*1/*3 CYP2C9*1/*13 CYP2C9*1/*1 CYP2C9*1/*3 CYP2C9*1/*13 CYP2C9*1/*1 CYP2C9*1/*3 CYP2C9*1/*13 CYP2C9*1/*1 CYP2C9*1/*3 CYP2C9*1/*13试验组399.88±167.00499.00±308.14600.99±302.14198.04±121.89191.60±132.55288.04±100.872.17±1.662.37±0.631.57±0.891.81±6.962.69±2.872.07±0.98对照组387.00±177.00489.00±132.00576.00±149.00187.00±58.00198.00±64.35301.00±104.002.08±0.411.98±0.561.67±0.691.65±0.602.30±0.701.78±0.80

图2 受试者氯沙坦血药浓度曲线A. CYP2C9*1 /*13 genotype B.CYP2C9*1 /*1 genotype C.CYP2C9*1 /*3 genotypeFig.2 The plasma concentration curve of losartan of volunteers

图3 受试者E-3174 血药浓度曲线A.CYP2C9*1 /*13 genotype B.CYP2C9*1 /*1 genotype C. CYP2C9*1 /*3 genotypeFig.3 The plasma concentration curve of E-3174 of volunteers

3 讨论

大豆类和大豆类植物性雌激素对人体健康的影响正逐渐受到关注[8]。黄豆苷元是大豆中的主要异黄酮类物质，可通过影响细胞凋亡或死亡、细胞周期、血管形成等发挥抗肿瘤作用[4，9]。黄豆苷和槲皮素均为大豆异黄酮，槲皮素可逆转多药耐药性，诱导CYP3A 的代谢活性，其诱导作用呈基因多态性[10]。黄豆苷元可显著影响健康受试者血浆他林洛尔代谢，且他林洛尔的药代动力学参数不受MDR1 第3435 位基因型影响[11]。槲皮素和黄豆苷元对转运体及细胞色素代谢酶的影响作用提示它们对其他经细胞色素代谢酶代谢的药物体内存在相互作用。

表3 两组受试者血浆样品中E-3174 药代动力学参数比较（±s，n=6）Tab.3 Comparison of pharmacokinetic parameters of E-3174 in plasma samples of volunteers in the two groups（±s，n=6）

表3 两组受试者血浆样品中E-3174 药代动力学参数比较（±s，n=6）Tab.3 Comparison of pharmacokinetic parameters of E-3174 in plasma samples of volunteers in the two groups（±s，n=6）

注：与CYP2C9*1/*1 基因型比较，*P＜0.05。Note：Compared with CYP2C9*1 /*1 genotype，*P ＜0.05.

指标AUC0-12 h（ng·h/mL）Cmax（ng/mL）tmax（h）t1/2（h）基因型CYP2C9*1/*1 CYP2C9*1/*3 CYP2C9*1/*13 CYP2C9*1/*1 CYP2C9*1/*3 CYP2C9*1/*13 CYP2C9*1/*1 CYP2C9*1/*3 CYP2C9*1/*13 CYP2C9*1/*1 CYP2C9*1/*3 CYP2C9*1/*13试验组2171.1±400.281779.2±308.141871.1±302.14398.04±121.89291.60±132.55*279.04±100.87*4.17±1.663.67±0.634.57±0.893.81±6.964.69±2.875.07±0.98对照组2514.00±789.001868.00±736.001832.00±644.00437.00±110.00332.00±136.00*320.00±88.00*4.08±0.413.33±0.564.28±0.693.70±1.105.02±0.905.30±1.70

氯沙坦属血管紧张素Ⅱ1 型（AT1）受体拮抗剂，临床广泛用于高血压的治疗，其主要活性代谢产物E-3174 的活性强于母药。CYP2C9 是氯沙坦代谢中的主要细胞色素代谢P450 酶，在人体内具有高度基因多态性，至今已发现30 种突变等位基因[12]。CYP2C9 在中国人群中的突变等位基因型主要为CYP2C9*1/*3 和CYP2C9*1/*13 两种[13]。这两种基因可降低E-3174 的Cmax，但对氯沙坦的药代动力学参数无显著影响。体内约有13.6%的氯沙坦代谢成E-3174。有研究报道，连续口服细胞色素氧化酶诱导剂利福平7 d 后，再口服氯沙坦50 mg，可使氯沙坦和E-3174的AUC分别降低35%和40%[14]。同时，体外研究也表明，利福平对原代培养的人肝细胞模型上的CYP2C9 和CYP3A4 酶有更强的诱导活性[15]。

本研究中，两组受试者均完成试验，无药品不良反应/事件发生。试验组中，与CYP2C9*1/*1 亚组比较，CYP2C9*1/*3 亚组和CYP2C9*1/*13 亚组受试者血浆E-3174 的Cmax均显著降低；对照组3 个亚组受试者血浆E-3174 的Cmax无显著差异；试验组和对照组3 个亚组受试者血浆氯沙坦的Cmax无显著差异；与对照组比较，试验组CYP2C9*1/*1 基因型受试者血浆E-3174 的Cmax显著降低。

综上所述，黄豆苷元对CYP2C9*1/*1 正常基因型健康受试者氯沙坦的代谢无显著影响；对于CYP2C9*1/*3及其*13 突变等位基因型健康受试者，可影响氯沙坦代谢生成E-3174，从而降低E-3174 的血药浓度，其临床意义有待进一步证实。