七氟醚预处理通过升高血浆脂联素水平保护心肌缺血/再灌注损伤

翟津津，孙一恺，刘彦宏，杨保仲，张彦清

(山西医科大学 1.麻醉学院, 2.附属第一医院麻醉科,3.研究生处，山西 太原 030001)

心外科冠脉再通手术中，心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia-reperfusion,MI/R)是无法避免的环节，而MI/R损伤是引起术后病人心功能不全和心力衰竭的重要因素[1]。因此，如何预防和治疗MI/R损伤就变得尤为重要。

大量研究表明，挥发性麻醉药(七氟醚，异氟醚等)预处理和后处理可以减少MI/R损伤[2-3]，然而其作用的分子机制尚未阐明。我们前期研究发现，小凹蛋白-3(caveolin-3，cav-3)在七氟醚心肌保护中发挥着重要作用[4]。cav-3可以和脂联素受体直接结合，是脂联素下游信号的关键分子[5]，脂联素是一种主要由脂肪细胞分泌的细胞因子，大量数据表明脂联素对心脏具有直接的保护作用[6-7]，循环脂联素浓度与心血管疾病关系密切相关[8-9]。但脂联素是否参与七氟醚预处理的心脏保护作用，目前尚不清楚。

本研究观察脂联素在七氟醚预处理的MI/R保护中的作用，有助于阐明七氟醚预处理的心肌保护作用机制，可望为挥发性麻醉药辅助心肌梗死患者血管再通手术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料动物 健康成年SPF级雄性C57小鼠30只，鼠龄8-10周，体质量(20-25) g，购自山西医科大学动物实验中心[许可证号SCXK(晋)2015-0001]。健康成年SPF雄性脂联素基因敲除鼠，10只，鼠龄8-10周，体质量(20-25) g，由上海南方模式生物科技有限公司提供。

主要药品和试剂 七氟醚，规格：100 mL，购自上海恒瑞医药有限公司；伊文思蓝(Evans blue)，2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)，均购自上海生工生物工程有限公司; 苏木素-伊红(HE) 染色试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；小鼠脂联素酶联免疫双抗夹心法试剂盒，购自美国博士德生物工程有限公司(EK0596)。主要仪器 Harvard小动物呼吸机，美国Harvard产品。Power PAC1000电泳仪、半干式转印仪以及酶标仪美国，均为美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1动物模型制备 七氟醚预处理：将单只小鼠放入麻醉罐中，向麻醉罐中通入2%七氟醚-93%氧气-5% CO2，10 min后，通入95%氧气-5%CO2，15 min 后换回2%七氟醚-93%氧气-5% CO2，如此循环3次。对照处理组通入95%氧气-5%CO275 min，预处理结束后，立即行MI/R造模手术或假手术。

MI/R模型建立：小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后固定于实验台上，直视下气管插管，连接小动物呼吸机，在左侧第四、五肋间行纵行切口，暴露心脏，左心耳下缘2 mm处穿针结扎。若看到左心室前壁以及心尖发白，表明结扎位置正确，则在缺血30 min后，松开结扎线，使血流重新灌注，关闭胸腔，模型建立完毕。假手术模型只穿线不结扎，其余操作同MI/R组。

1.2.2超声心动图检测 再灌注24 h后，行心脏超声检测前，用脱毛剂将小鼠胸部脱毛备皮。检测时，将小鼠用异氟醚和氧气混合吸入麻醉，置于恒温检测台上，设置40 ℃，小鼠四肢用胶布固定。胸前和超声探头涂抹电容胶，进行M型超声检测。检测左心室射血分数、左心室收缩末期内径和左心室舒张末期内径。

1.2.3心肌伊文思蓝-TTC染色 再灌注24 h后，再次结扎左冠状动脉，将0.2 mL 2%伊文思蓝从左侧颈静脉注入，观察小鼠四肢和嘴唇发青时，迅速摘取心脏，生理盐水冲洗干净血渍，滤纸吸干多余水分，剪掉多余组织，放入-20 ℃冰箱冰冻10 min，取出，均匀切片1 mm，放入2%TTC溶液中，于37 ℃恒温箱中避光孵育30 min，将切片置于4%多聚甲醛固定24 h，拍照。ImageJ图像分析软件分析梗死面积。

1.2.4心肌Tunel染色 心肌组织经常规甲醛固定、石蜡包埋、切片，将石蜡切片常规脱蜡，采用末端脱氧核苷基转移酶介导的dUTP原位平端标记法染色检测细胞凋亡。染色结束后，显微镜下观察并拍照，结果以Tunel阳性细胞核/总细胞核×100%表示。

1.2.5血浆脂联素水平检测 颈总动脉采血，4 ℃、3 000 r·min-1离心10 min后，取上清，严格按照试剂盒说明测定脂联素水平。

2 结果

2.1 各组小鼠术后24 h心脏功能比较在麻醉状态测定的各项指标显示：与假手术组相比，MI/R手术后模型组小鼠的射血分数降低(Fig 1B,P<0.05)，左心室舒张末期内径(Fig 1C)以及收缩末期内径(Fig 1B)增加；与模型组比较，预处理组各项指标均改善(Fig B，P<0.05)；相比预处理组，敲基因预处理组七氟醚预处理改善作用降低(Fig 1B-D)。

Fig 1 Heart function after MI/R improved by sevoflurane pretreatment

Fig 2 Area of cardiac infarction after MI/R reduced by sevoflurane pretreatment

2.2 各组小鼠术后24 h后心肌梗死面积比较术后24 h后，对各组小鼠进行伊文思蓝-TTC染色，结果如Fig 2A所示，相比于假手术组，模型组心脏缺血区出现明显坏死区；对比于模型组，预处理组心梗面积减少(P<0.05)；与野生鼠组相比，敲基因七氟醚预处理减少心梗面积的作用减弱。

2.3 各组小鼠24 h后缺血区心肌组织细胞凋亡比较对各组小鼠缺血区心肌组织进行Tunel染色，观察七氟醚预处理对心肌MI/R后心肌细胞的影响。与假手术组相比，模型组凋亡细胞数目增加(P<0.05)；相比于模型组，预处理组凋亡细胞数目减少(P<0.05)，同时，敲基因预处理组七氟醚预处理降低凋亡细胞的作用减弱。

2.4 各组小鼠血浆脂联素水平比较对各组小鼠血清脂联素进行检测，结果如Fig 4所示，相比于假手术组，模型组血浆脂联素水平明显降低(P<0.05)；七氟醚预处理显著增加血浆脂联素水平。

3 讨论

七氟醚是临床上应用最为广泛的一种吸入挥发性气体麻醉药，其预处理和后处理对心肌的保护作用已得到广泛认可[2-3]。Zhao等[10]发现，在cav-3基因敲除的小鼠，七氟醚预处理的心肌保护作用降低。脂联素是一种主要由脂肪组织分泌的细胞因子，具有直接的心肌保护作用[6, 11]。Wang等[5]发现，cav-3在脂联素跨膜信号传导和抗缺血心脏保护作用中起着至关重要的作用。Cav-3在七氟醚对MI/R的心肌保护作用和脂联素心肌保护作用中均发挥关键性作用，提示七氟醚对MI/R的心肌保护可能是通过对脂联素表达水平的调控来发挥作用的。关于脂联素是否参与七氟醚预处理的心肌保护作用目前未见报道。本研究通过使用野生型和脂联素基因敲除小鼠，探讨脂联素在七氟醚预处理心脏保护中发挥的作用。

Fig 3 Cardiomyocyte apoptosis after MI/R reduced by sevoflurane pretreatment

Fig 4 Plasma adiponectin levels increased by sevoflurane pretreatment

MI/R是心脏外科手术中不可避免的，血液再灌注会引起缺血心脏发生一系列病理生理改变，导致心脏功能发生剧烈改变[1]，我们实验结果同样显示，模型组再灌注24 h后，心脏活动功能受限，出现不可逆坏死区。挥发性气体麻醉药预处理和后处理在动物和人体，已经证实具有心脏保护功能[1-2, 12]；我们的实验结果同样证实了此结果，七氟醚预处理组，心肌凋亡细胞数目减少，梗死面积缩小，心功能改善，结果与Mathur等[13]的报道相一致。大量临床研究和动物实验均表明，急性心梗后血中的脂联素水平表达减少[14-15]，而血浆脂联素的增加可改善心肌损伤[7, 16]，与我们的实验结果一致。通过检测各组小鼠血浆脂联素水平发现，对照组血浆脂联素水平降低，同对照组相比，七氟醚预处理组血浆脂联素水平增加。

一项回顾性Meta分析显示，在包括糖尿病在内的许多临床病症中，脂联素与死亡率之间存在正相关而非预期的负相关关系[17-18]，对脂联素作为治疗心血管疾病潜在靶点提出质疑，Scarale等对该争议点相关的调节因子进行总结后指出脂联素与死亡率相矛盾的关系可能与利钠肽有关。Asensio-López、Guo等报道发现，二甲双胍和替米沙坦可通过调节脂联素系统发挥心脏保护保护作用；我们结果显示，相比于七氟醚预处理组，敲基因预处理组七氟醚心脏保护作用不明显，心肌凋亡细胞数目，梗死面积以及心功能无差异。提示七氟醚预处理心脏保护作用可能与脂联素相关。

我们的实验结果显示，七氟醚预处理减轻心肌细胞凋亡、减少梗死面积、改善MI/R后心脏功能，这一心脏保护作用在脂联素敲除小鼠中大部分消失，提示七氟醚预处理的MI/R保护作用可能和增加血浆脂联素浓度有关。这一发现有望为临床使用七氟醚改善血管再通术后患者心功能提供理论依据。