HPLC法测定保健食品胶囊壳中合成着色剂含量

黄玉琴

（宁德市食品药品检验检测中心，福建宁德 352100）

如今人们对于合成着色剂的添加认知多是在饮料、果冻、熟肉制品中，在这些食品中，国家规定其能够添加一定量的合成色素，但本文所探究的保健食品胶囊壳是否超范围添加合成着色剂却往往容易被人们所忽视。目前，保健食品的理化指标检测主要针对内容物，涉及其包材即明胶空心胶囊的检测较少。因此，对保健食品胶囊壳中合成着色剂进行监测，可有效控制合成着色剂的滥用，对保障食品安全具有重要意义。

国内外对于是否添加或非法添加合成着色剂的检测方法众多，主要有高效液相色谱法[1-2]、高效液相色谱-质谱联用法[3-5]、薄层色谱法、示波极谱法等[6]。高效液相色谱法由于仪器普及率高、操作简便、灵敏度高、准确性好等特点，被广泛应用。而其中最常见的方法是国家标准中使用的聚酰胺吸附法以及液-液分配法[7-8]。此法的缺点是操作繁杂，在254 nm波长下进行检测，无法有效排除杂质干扰。

本文采用水浸法提取和聚酰胺SPE固相萃取柱富集洗脱胶囊壳中合成着色剂，优化高效液相色谱条件，使用各合成着色剂的特征波长进行测定，同时进行方法学验证，研究建立了一种用高效液相色谱法测定保健食品胶囊壳中7种合成着色剂含量的方法。采用该方法对13批明胶空心胶囊和4批保健食品胶囊壳进行测定，均检测出国标允许使用的合成着色剂，并对结果进行分析，为保健食品监管提供建议。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

胶囊壳样品来自市场购买的13种有色空胶囊及4种有色保健食品胶囊壳。

标准物质：柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝（中国计量科学研究院，浓度1 mg/mL）；诱惑红、赤藓红（北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司，浓度1 mg/mL）；甲醇（美国J.T.Baker，色谱纯）；乙酸铵、无水乙醇、氨水（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；试验用水为超纯水。

1.1.2 仪器

高效液相色谱仪（安捷伦1260，DAD检测器）；色谱柱（安捷伦ZORBAX SB-C18， 250 mm×4.6 mm， 5 µm）；聚酰胺固相萃取柱（北京振翔科技有限公司，1 g/6 mL）；旋蒸仪（WZ-100SP，上海申生科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件、合成着色剂的特征波长

色谱柱：安捷伦ZORBAX SB-C18， 250 mm× 4.6 mm，5 µm；流动相：A甲醇，B乙酸铵（0.02 mol/L）；梯度洗脱程序：0～8 min，5% A；8～14 min，35% A；14.00～18.10 min，98% A；18.10～25.00 min，5% A；流速：1.00 mL/min；检测波长：柠檬黄428 nm、苋菜红523 nm、胭脂红510 nm、日落黄482 nm、诱惑红510 nm、亮蓝625 nm和赤藓红531 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 µL。

1.2.2 标准品中间液和使用溶液的制备

（1）标准品中间液的配制。从柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝和赤藓红标准品溶液中各取2.0 mL于20 mL容量瓶中，加水定容，得到标准品中间液100 µg/mL。

（2）标准品使用溶液的配制。从标准品中间液中分别取0.5 mL、1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL和10.0 mL于50 mL溶液瓶中，加水定容；分别得到1.0 µg/mL、 2.0 µg/mL、5.0 µg/mL、10.0 µg/mL和20.0 µg/mL的标准品使用溶液。

1.2.3 胶囊壳预处理

有色明胶空心胶囊13种（市购），去除白色部分。胶囊壳带颜色的保健食品4种（市购），分别倒出硬胶囊内容物，用棉签粘无水乙醇，清净胶囊壳内表面内容物。

1.2.4 样品测定

取样品约1 g，加入30 mL 60 ℃的热水进行溶解，取1.0 mL溶解液通过聚酰胺SPE固相萃取柱，柱子流速为5滴/min（活化：加入5 mL甲醇、5 mL水、5 mL pH=6的水），淋洗（10 mL水）、洗脱（加入15 mL氨水-乙醇2∶8洗脱），收集洗脱液，于60 ℃旋蒸至近干，用水定容至10 mL，过滤，取10 µL用于高效液相色谱测定。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 溶解温度

针对胶囊壳在不同水温下的溶解度不同，分别取50 ℃、60 ℃、70 ℃热水进行溶解。结果表明，当水温在50 ℃时，胶囊壳不能完全溶解，在60 ℃和70 ℃下，胶囊壳完全溶解。根据温度越低能量损耗越低，将溶解温度定为60 ℃。

2.1.2 称样量

各取3份样品（1份称0.5 g，1份称1.0 g，1份称 2.0 g），各加入30 mL 60 ℃热水，取溶解液定容至10 mL，上机检测。结果表明，称样量为0.5 g与2.0 g 时，各着色剂的回收率仅为60%～70%；而称样量在1 g的情况下，收率能够达到80%以上，因此将称样量定为1 g。

2.1.3 梯度比例

参考《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》（GB 5009.35—2016），洗脱比例设置如表1所示，其中第3组的流动相比例，分离效果最佳，满足试验要求。因此，本试验采用第3组的梯度洗脱比例。

表1 梯度洗脱比例表

2.1.4 波长

使用254 nm波长检测得到的分离谱图如图1所示，其存在杂质干扰而得不到良好的检测结果；使用各合成着色剂特征波长检测得到的分离谱图如图2所示，其特征峰明显，能排除杂质干扰。因此，使用特征波长检测出的结果要比使用254 nm波长检测出的结果精确。

图1 使用波长为254 nm的分离谱图

图2 使用特征波长的分离谱图

2.1.5 试验时间

由于胶囊壳是食用级的明胶经过处理制造而成的用于盛装固体粉末、颗粒的卵状空心外壳。经过热水溶解后冷却，每过1 h观察其凝固程度。发现经过12 h会重新凝固，因此实验测量时间不宜过长，否则会发生凝固，导致测量结果出现误差。

2.2 方法学验证

2.2.1 线性实验学验证

分别设置：1.0 µg/mL、2.0 µg/mL、5.0 µg/mL、10.0 µg/mL和20.0 µg/mL5个浓度点，按上述色谱条件分别进样10 µL进行测定。如表2所示，7种合成着色剂的标准曲线呈现良好的线性关系，相对系数均大于0.999 0。

表2 各合成着色剂的线性范围、回归方程和相关系数

2.2.2 精密度试验

根据所测浓度的峰面积标准偏差除以峰面积平均值得出相对标准偏差，可计算得出7种着色剂不同浓度、不同基质的RSD值。由表3可知，该试验测得的RSD值均小于1%，表明具有较理想的精密度。

表3 各合成着色剂的RSD值

2.2.3 回收率试验

选取3个浓度水平进行加标回收率测定，每个浓度水平独立测定3次。测定结果如表4所示，各标准品回收率为86.42%～96.70%，回收率相对标准偏差＜1%，表明该方法的回收率符合测定要求，准确度良好。

表4 各合成着色剂的回收率表

2.2.4 检测限与定量限

以信噪比（S/N）=3，设定检出限为0.5 mg/kg，经试验检测，可有效测出目标物质，结果如图3所示。以信噪比（S/N）=10，设定量限为2.0 mg/kg，试验检测效果良好，结果如图4所示。根据《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）可知，7种合成着色剂的最大限量范围为0.01～0.60 g/kg，本文测得的检测限与定量限均低于最大限量范围，证明方法可行。

图3 检测限为0.5 mg/kg时的色谱图

图4 定量限为2 mg/kg时的色谱图

2.2.5 稳定性试验

取1 g样品，加入标准使用溶液5 µg/mL，依照1.2.4方法使用各合成着色剂特征波长进行检测，分别在0 h、4 h、8 h和12 h测得各组峰面积。由表5 可知，7种合成着色剂在12 h内的峰面积保持稳定，计算得到RSD均小于1%，表明样品在12 h内保持稳定。

表5 各合成着色剂不同进样时间内峰面积的变化数据

2.3 结果测定

13批明胶空心胶囊（样品编号1～13）和4批市面常见保健食品胶囊壳（样品编号14～17）测定结果如表6所示，可以看出合成着色剂的含量范围在0.02～5.90 g/kg，不同颜色的胶囊壳中含合成着色剂种类不同，含1种合成着色剂的有5批，含2种合成着色剂的有5批，含3种合成着色剂的有5批，含4种合成着色剂的有1批，含5种合成着色剂的有1批。对照国家标准《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014），13批空胶囊中有9批合成着色剂超出标准范围上限，4批市面常见保健食品胶囊壳中有3批合成着色剂超出标准范围上限。

表6 13种明胶空心胶囊及4种保健食品胶囊壳测定结果

3 结论与讨论

本研究利用安捷伦1260型高效液相色谱仪（DAD检测器）能够实现在不同时间段变换波长进行分段数据采集的特点，采用水浸法提取和聚酰胺SPE固相萃取柱富集洗脱胶囊壳中合成着色剂，优化高效液相色谱条件，使用各合成着色剂的特征波长进行测定，同时进行方法学验证，研究建立了一种用高效液相色谱法测定保健食品胶囊壳中合成着色剂含量的检测方法。7种合成着色剂分离效果良好，在1～20 µg/mL呈现良好的线性关系，相对系数均大于0.999 0，回收率为86.42%～96.70%，RSD均小于1%。检出限为0.5 mg/kg，定量限为2.0 mg/kg。采用该方法对13批明胶空心胶囊和4批市面常见保健食品胶囊壳进行合成着色剂含量检测，均检出国标[8]允许使用的合成着色剂，该方法适用于保健食品胶囊壳中合成着色剂的测定。由于明胶空心胶囊广泛用于包装药品或保健品，存在合成着色剂滥用的安全风险。因此，国家应建立一种科学的针对保健食品胶囊壳中合成着色剂的限量标准，并加强对保健食品胶囊壳中合成着色剂的检测。