MiR-4258靶向调控CDH19对膀胱癌T24细胞分化和侵袭能力的影响

曹罗元，杨 菁，富显果，董文婿，林应华，黄宝英

(宁德师范学院附属宁德市医院中心实验室，福建宁德 352100)

MiRNAs与靶mRNA的3′UTR(untranslated region)区的碱基互补配对而起作用，使其降解或抑制其表达，从而导致特定基因的沉默，对机体生长、发育及各种疾病尤其是肿瘤的发生和发展具有重要的调节功能[1-3]。

膀胱癌是发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤；发病率在我国泌尿生殖系肿瘤中位列第1，约30%患者确诊时已发生远处转移[4]。特别是高度恶性或侵犯肌层的膀胱癌采用化学疗法也容易复发和转移[5-6]，尚未发现有效的治疗策略。采用特异的生物学标记分子进行早期诊断和病情评估是防治膀胱癌的关键，而全基因组分析法为膀胱癌发现新的生物学标记分子提供了思路，其中miRNAs因其成为标记分子的潜力最大，而受到极大的关注。既往研究表明，miR-143、miR-222和miR-452可作为膀胱癌肿瘤细胞分级和非侵袭性诊断的生物学标记分子[7]；miR-325可作为膀胱癌的抑制分子[8]；miR-99a可通过调控成纤维细胞生长因子受体-3的活性，以抑制膀胱癌细胞增殖、侵袭和转移[9]；miR-99a可作为一个有价值的诊断性生物标志分子[10]；miR-96作为膀胱癌患者的治疗靶点[11]，以上研究表明miRNA在膀胱癌进程中发挥着重要作用，使miRNAs作为肿瘤标记分子成为可能。

PASCUT等[12]研究发现miR-4258在脂肪变性过程中存在关联性，本课题组在肾小管上皮细胞转分化过程中发现下调miR-4258可抑制转分化过程[13]。既往研究表明细胞分化过程与肿瘤侵袭和迁移密切相关[14-16]，但关于miR-4258在膀胱癌侵袭转移过程中的调控机制尚未见文献报道，我们对此进行研究，寻找防护和治疗膀胱癌提供新的潜在靶点。本研究发现miR-4258在CDH19 3′UTR存在调控结合位点；miR-4258可能通过下调CDH19的表达水平，进而促进了T24细胞分化，增强了膀胱癌T24细胞的迁移和侵袭能力。现将研究结果汇报如下。

1 材料与方法

1.1 研究材料人膀胱移行细胞癌细胞系T24购自中国科学院上海细胞库。11例癌组织及癌旁正常组织取自宁德师范学院附属宁德市医院膀胱尿路上皮癌患者手术切除标本，男性7例，女性4例，患者年龄为(57.42±12.67)岁；经我院伦理委员会批准，术前告知标本用途，并签订了知情同意书。实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，Rt-qPCR)试剂盒购自TaKaRa公司；培养基RPMI-1640、胰蛋白酶(Trypsin)、胎牛血清购自Gibco公司，脂质体2000购自Thermo公司，pmirGLO载体购自美国Promega公司。miRNeasy mini试剂盒均购自Qiagen公司。CDH19、E-cadherin和α-SMA抗体均购自Abcam公司，所用内参和二抗购自Santa cruz公司。使用来自上海吉玛制药技术有限公司miR-4258 mimics、miR-4258 inhibitor、阴性对照(miRNA-ctrl)和实时定量PCR引物。

1.2 细胞分组和转染T24细胞分miR-ctrl对照组、miR-4258 mimics组和miR-4258 inhibitor组，每组细胞按1.5×105个/孔密度接种于6孔板中。培养24 h后按照Invitrogen说明书将待转染的miRNA oligomer 与脂质体2000 均匀混合后，室温静置20 min 后滴入各组细胞孔板，6 h后换完全培养基液。所有分组细胞均在37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养。

1.3 靶基因预测和荧光素酶验证实验TargetScan 7.2和miRwalk 2预测miR-4258的靶基因，通过荧光素酶报告实验进行靶基因验证。CDH19上游引物5′AGCTTTGTTTAAACCG AACCCAATGGTAGTCTTA3′，下游引物5′CCGCTCGAGTAGAATGAATCATGGCATCT3′；CDH19突变上游引物5′AGCTTTGTTTAAACCCTGGCTCTATGGCTTTGAAAGCCCTA3′，下游引物5′CCGCTCGAGTAGAATGAATCATGGCATCT3′；构建野生型质粒pmirGLO-3′UTR-CDH19-WT和pmirGLO-3′UTR-CDH19-MUT突变型质粒。使用0.5 μg pmirGLO，pmirGLO-3′UTR-CDH19-WT和pmirGLO-3′UTR-CDH19-MUT分别与25 nm的miR-4258 mimics或25 nm的miR-NC共转染T24细胞。

1.4 定量PCR检测miR-4258差异表达用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，分光光度计定量检测RNA样品，将A260 nm/A280 nm比值为1.8～2.1的RNA样品逆转录为cDNA，以cDNA为模板定量样本中miR-4258和U6snRNA的表达量。miR-4258上游引物5′GCATCCCCGCCACCG3′，下游引物5′TATCGTTGTTCTCCACTCCTTCAC3′；U6snRNA上游引物5′ATTGGAACGATACAG AGAAGATT3′，下游引物5′GGAACGCTTCACGAATTTG3′。采用TaKaRa SYBR PrimeScriptTMmiRNA RT-PCR Kit，经ABI StepOnePlus Real-Time PCR System扩增。以U6snRNA为内参，根据2-△△Ct各组基因的相对含量，实验独立重复3次，3次结果取平均值。

1.5 免疫印迹(Western blot)检测CDH19、E-cadherin和α-SMA的表达T24细胞按分组干预培养72 h，提取各组总蛋白，经BCA定量后，取细胞裂解蛋白10 μg，经10 g/L SDS-PAGE 凝胶电泳2 h，聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride membrane，PVDF)转膜(200 mA，1 h)； 50 g/L脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h，分别加入E-cadherin、α-SMA、CDH19和磷酸甘油醛脱氢酶抗体，4℃过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h；洗膜后加电化学发光剂(electrochemiluminescence，ECL)显影，将PVDF 膜放入Bio-Rad 化学发光成像系统中成像，每组实验独立重复3次，3次结果取平均值。所得免疫印迹通过Image J软件获得各实验组与内参灰度值的比值。

1.6 细胞迁移实验(Transwell)小室细胞侵袭能力检测各组细胞接种前进行饥饿培养12 h，将Transwell小室(已铺Matrigel胶)室温水化后将膀胱癌细胞T24细胞基础培养基200 μL/室接种于Transwell小室上室，细胞终浓度为1×104个/室；向下室加入600 μL含体积分数为20%的胎牛血清的培养基。37 ℃、体积分数为5%的CO2培养24 h，后取出Transwell小室，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞1 g/L结晶紫染色，倒置显微镜下观察，计数各个小室细胞数。

1.7 明胶酶谱法测定MMP-2活性各组细胞培养48 h，收集各组同体积培养液浓缩后，在10%的聚丙烯酰胺凝胶(含0.1 %明胶)电泳分离蛋白，体积分数为2.5%的TritonX-100洗30 min 2次，后将凝胶置于孵育液中37 ℃孵育48 h。经染色液染色，甲醇脱色后，显示出透亮带，采用Image J分析。

2 结 果

2.1 miR-4258靶基因预测和验证在线生物信息预测数据库预测miR-4258的靶基因，提示miR-4258潜在的作用靶基因是CHD19(图1A)。CDH19是位于18号染色体上，编码一种钙依赖细胞-细胞黏附糖蛋白，是Ⅱ型钙黏蛋白基因，钙黏蛋白的丢失可能与癌症的形成有关。

我们通过荧光素酶报告实验进行靶基因验证，发现当重组质粒和miR-4258 mimics共转染T24细胞时，CDH19-3′UTR-WT野生型组的荧光素酶活性较对照组显著下降(图1B)，而突变型组荧光素酶活性无明显变化。说明CDH19是miR-4258的直接靶点，miR-4258通过直接与CDH19的3′UTR上的序列结合，抑制CDH19的转录，负调控CDH19蛋白的表达；且RT-qPCR结果显示，miR-4258在膀胱癌及癌旁正常组织中的相对表达量分别为(6.63±1.49)和(2.79±0.68)，两组比较差异有统计学意义(t=3.711，P<0.01，图1D)。

2.2 miR-4258对T24细胞分化的作用Western blot检测 miR-4258 mimics和inhibitor对膀胱癌细胞T24上皮间充质转化标志蛋白的作用，发现与miR-ctrl组相比miR-4258 mimics组中的E-cadherin和CDH19蛋白表达量显著降低，而α-SMA的表达明显下调(图2)。E-cadherin在上皮细胞间质转化过程中发挥着重要的作用，对维持上皮细胞黏性和极性具有重要的作用。α-SMA作为间质细胞特征分子，是判断间质细胞的重要标志蛋白。既往研究表明上皮-间充质转化过程与上皮细胞的肿瘤密切相关[14-16]。本研究发现miR-4258的差异表达和T24细胞上皮-间充质转化过程密切相关，可能通过调控上皮-间充质转化过程，进而发挥在肿瘤侵袭转移过程中的调控作用。

A:Western blot检测E-cadherin的蛋白表达水平；B:Western blot检测CDH19和α-SMA的蛋白表达水平；C：E-cadherin、CDH19和α-SMA的蛋白相对表达水平。与miR-ctrl组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 miR-4258对膀胱癌T24细胞侵袭能力的影响膀胱癌T24细胞是高度转移性的细胞，为了探究miR-4258是否影响T24细胞侵袭能力，本研究通过Transwell侵袭实验发现，与miR-ctrl组相比，miR-4258 mimics 组侵袭细胞数目显著增加[(82±6.81)vs.(60±5.57)，P<0.01]；miR-4258 inhibitor组侵袭细胞数目显著减少[(42±4.58)vs.(60±5.57)，P<0.01]，而miR-ctrl组和正常处理组差异无统计学意义(图3)。

A：Transwell实验测定各组细胞迁移能力(结晶紫，×100)；B:实验各组细胞迁移数量。与miR-ctrl组比较，*P<0.05,** P<0.01。

2.4 miR-4258对基质金属蛋白酶2酶活性的影响基质金属蛋白酶几乎能够降解细胞外基质的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起到了关键作用。基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)基因是基质金属蛋白酶家族的重要成员，属于明胶酶，涉及肿瘤细胞生长、凋亡、迁移、侵袭和转移，是最重要的抗肿瘤靶标。明胶酶谱法是一种简单而有效的检测蛋白水解酶的方法。本研究采用明胶酶谱法测定miR-4258对T24细胞MMP2酶活性的影响，结果显示，miR-4258 mimics组MMP2酶活性较miR-ctrl组显著提高，而miR-4258 inhibitor组MMP2酶活性较miR-ctrl组明显降低，说明miR-4258表达水平影响了MMP2活性(图4)。

A：明胶酶谱法测定各组细胞MMP2酶活性；B:MMP2相对酶活性；与miR-ctrl组比较，

3 讨 论

近年来研究发现miRNAs在肿瘤发生发展过程中起着重要作用，miRNAs可能成为肿瘤诊断和治疗的新靶点[17-19]，如尿液中miR-96与miR-183可作为膀胱上皮癌的肿瘤标记物[20]。BRAICU等[21]研究表明miRNAs将作为膀胱癌预后的关键分子，该团队在膀胱癌中发现的miRNA-mRNA调控网络作为生物标志物或靶向治疗策略的开发时机或已成熟。因此，肿瘤细胞特异miRNA的差异表达将为肿瘤早期诊断带来巨大的便利与突破[22-24]。肿瘤细胞侵袭转移是恶性肿瘤的主要特征，伴随着肿瘤的发展，肿瘤细胞的黏性不断下降，而侵袭转移能力不断增强[25]。以上研究说明，miRNAs在膀胱癌侵袭和转移过程中发挥着重要的作用，可作为膀胱癌潜在生物标志物和治疗的靶点，具有重要的临床指导意义。本课题组选取当前癌症治疗方案-基因靶向治疗中的miRNA进行研究，我们通过RT-qPCR检测膀胱上皮癌组织及癌旁正常组织的miR-4258表达情况。结果表明，miR-4258在膀胱上皮癌组织中的表达水平明显高于其癌旁组织，差异有统计学意义(t=3.711，P<0.01)。为进一步研究miR-4258在膀胱癌中的具体作用及调控机制，我们通过生物信息学软件预测miR-4258的靶基因并采用荧光素酶报告基因实验进行验证；结果显示，CDH19是miR-4258的靶基因。随后，我们采用细胞实验进一步探究了miR-4258对细胞分化和侵袭的影响，运用脂质体转染技术将miR-4258 mimics、inhibitor和miR-ctrl分别转染至膀胱癌T24细胞中，检测mRNA和蛋白的表达水平。结果表明与miR-ctrl相比，miR-4258 mimics组CDH19和E-cadherin的蛋白表达水平显著下调(P<0.05)，而α-SMA的表达水平显著提高(P<0.01)；说明miR-4258的过表达促进了T24细胞的转分化过程，而既往研究表明细胞分化过程与肿瘤侵袭和迁移密切相关[14-16]。通过侵袭实验和检测MMP2酶活性探讨miR-4258对膀胱癌生物学功能的影响，结果发现，miR-4258 mimics组MMP2的活性较miR-ctrl组显著提高(P<0.01)，同时T24细胞的侵袭能力也得到明显增强。

CDH19是钙依赖性细胞黏附糖蛋白，钙黏蛋白的丢失可能与癌症的形成有关，CDH19在恶性胶质瘤进程中具有重要的作用[26]。我们发现在T24细胞中，miR-4258通过靶向负调控CDH19的表达水平，miR-4258的差异表达能够显著影响CDH19 mRNA及蛋白质的表达，来调控T24细胞的分化、侵袭。同时miR-4258 mimics也增强了T24细胞的迁移能力，并提高了MMP2的酶活性。MMP2是降解上皮细胞向间质细胞转分化过程中所生成的细胞外基质的主要分子，它通过血管和淋巴系统在膀胱癌的肿瘤侵袭和末端转移过程中发挥着重要作用。

综上所述，miR-4258在膀胱上皮癌组织中显著高表达，上调miR-4258表达促进了T24细胞的分化和侵袭能力，其调控方式可能是miR-4258靶向调控CDH19的表达，进而发挥在膀胱癌T24细胞分化和侵袭过程中的调控作用；提示miR-4258在膀胱癌细胞生物学功能中发挥重要作用。后续我们将在组织学上进一步验证CDH19的差异表达，比较膀胱癌组织和癌旁组织间CDH19的表达水平，以及miR-4258的动物实验研究，继续探究miR-4258作为膀胱癌生物学分子标记的可能性，为临床实践中膀胱癌的诊疗提供科学依据与实践基础。