孕期营养补充剂对妊娠母鼠和仔鼠行为学影响*

张长勇 白兢毳 暴 国 何嘉玲 李 楠 王尚明 张 斌 张树成 孙德明 王 宁 王天奇*

(1. 国家卫生健康委科学技术研究所，北京 100081)(2. 北京市朝阳区太阳宫社区卫生服务中心，北京 100028)

孕母与胎儿的关系十分密切，任何影响母亲健康发育的因素都有可能同时影响胎儿发育，进而影响子代的健康[1]。孕期营养尤为重要，因为围生期是生命过程中对营养状况最为敏感的时期，胎儿生长发育所需的营养来自母体，孕期均衡营养是胎儿生长发育的基础，孕期营养不良和营养过剩均影响胎儿生长发育[2]。中枢神经系统的发育和智力水平取决于3个重要因素：遗传、环境和营养。人体必需微量元素在人体内具有重要功能，它们具有高度的生物活性，是维持正常生命活动所必须，其中主要是参与多种酶的组成和激活，但其作用又是相当复杂的，它与人体生理、病理的改变都有密切的关系[3]。微量元素之间能够互相影响，有拮抗或协同作用，微量元素含量不足或过多对机体均可产生不良影响，胎儿出生低体质量，成人后高血压、冠心病、卒中和糖尿病率和死亡明显增高[4]。近年来，关于微量元素对胎儿及新生儿生长发育的作用已受到广泛的关注。胎儿期是中枢神经系统发育最快也是最容易受外界影响的时期，脑细胞在这一时期对营养不良非常敏感，胎儿期营养不良比出生后营养不良对智力的影响更大更持久。旷场试验是在自然状态下观察实验动物的活动情况，主要用于评价实验动物的运动功能、探究行为和情绪反应等，在神经精神药理学和行为药理学的研究领域中广泛应用[5-6]。本研究用昆明小鼠为研究对象，通过旷场行为实验，观察产后孕鼠和子代小鼠的探索行为，同时观察出生后小鼠体质量的变化和低体质量发生率的比较，研究孕期添加营养补充剂对母鼠和子代小鼠行为能力、以及对仔鼠生长发育的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级昆明雌鼠40只，雄鼠20只，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK-(军)2007-004。饲养于国家卫生健康委(原卫生计生委)科学技术研究所实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK(京)2018-0010。雌雄比例2∶1交配后怀孕母鼠进行灌胃处理，仔鼠21 d离乳后对母鼠进行旷场实验测试；仔鼠离乳后一周随机选取雌雄各20只进行旷场实验测试。

1.2 方法

1.2.1药物剂量与分组:朴美牌多种维生素多种矿物质片(北京紫竹药业有限公司)，即孕期营养补充剂的孕早期、孕中期、孕晚期产品(生产批号分别为20121203、20120909、20121102)。

SPF级昆明小鼠交配见栓后随机分为低剂量组、中剂量组、高剂量组和溶剂对照组，孕期添加营养补充剂(孕早期、孕中期、孕晚期3个阶段的产品)按人体推荐日摄入量2 g/d换算小鼠的等效剂量，以等效剂量的0.5倍、1倍、2倍作为低、中、高3个剂量组的药物剂量，分别为150 mg/(kg·d)、300 mg/(kg·d)、600 mg/(kg·d)，连续灌胃6 d，休息1 d后使用下一阶段产品，直至生产。即3个剂量组均在见栓第1～6天使用孕早期营养补充剂，第8～13天使用孕中期营养补充剂，第15～20天使用孕晚期营养补充剂，溶剂对照组灌胃等剂量的溶剂安慰剂。

1.2.2仔鼠体质量监测:记录仔鼠出生、21 d离乳时和离乳后一周的体质量。

1.2.3旷场实验:采用立方形灰色木质旷场箱，其底面为灰色，用黑线划分为25个正方形格(20 cm×20 cm)，分为沿侧壁的16个外周格，其余为中心9个中央格，摄像头置于中央格正上方。所有的实验都在08：00～12：00完成。实验时将动物放入箱内底面中心，实验人员远离旷场箱，同时进行摄像5 min，每次实验结束后用酒精清洗方箱内部，以免影响下次测试。实验完成后，观看5 min内小鼠自发的水平运动(穿过方格的次数)和垂直运动(直立)的次数。

1.3 统计方法

实验数据使用 SPSS 19.0统计软件进行统计分析，进行独立样本方差分析，采用Dunnett-t检验。与对照组比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 仔鼠出生体质量、离乳体质量和离乳后一周体质量的比较

仔鼠出生体质量的比较见表1所列。孕鼠每胎(窝)仔鼠出生体质量在低剂量组、中剂量组和高剂量组呈增加趋势，其中高剂量组在雌性、雄性仔鼠和总的仔鼠的出生体质量与溶剂对照组比较均明显增加(P<0.05)，雌性仔鼠、雄性仔鼠和总的仔鼠分别增加11.96%、13.30%和12.26%。提示妊娠期母鼠补充多种维生素和矿物质营养补充剂出生仔鼠体质量增加。

表1 出生仔鼠体质量的比较Table 1 Comparison of birth weight

离乳和离乳后一周仔鼠体质量见表2所列。哺乳21 d后，3个实验组仔鼠体质量较对照组明显增加(P<0.05，P<0.01)；其中，雌性仔鼠在三组中分别增加4.78 g、4.93 g和12.57 g；雄性为7.69 g、8.64 g和11.11 g。平均每只仔鼠增加为6.21 g、6.89 g和11.79 g。离乳后一周后，3个实验组仔鼠体质量较对照组明显增加(P<0.01)。其中，雌性仔鼠在三组中的体质量分别增加13.87 g、13.65 g和16.11 g；雄性分别增加18.60 g、19.95 g和20.68 g；平均每只仔鼠体质量增加16.79 g、17.31 g和19.09 g。

表2 离乳及离乳后一周仔鼠体质量变化的比较Table 2 Comparison of body weight changes of weaners and 1 week after weaning

2.2 对产后孕鼠自主活动的影响

母鼠于产后(25～30 d)进行旷场实验测试(表3)。与溶剂对照组比较，高剂量组行为学分析的自主活动参数测试显示，在水平运动和垂直运动两项分析指标无明显变化(P>0.05)，在中央区停留时间及穿越中央区次数两项分析指标有增加的趋势，分别增加33.02%和28.11%，但差异无统计学意义(P>0.05)，提示孕期给予高剂量营养补充剂具有增加孕鼠产后探索行为的趋势。

表3 对产后母鼠自主活动的影响(n=10)Table 3 Effect on the voluntary activity of postpartum female rats (n=10)

2.3 对仔鼠自主活动的影响

对雌性小鼠自主活动的影响见表4所列。与溶剂对照组比较，雌性仔鼠水平运动和垂直运动指标无明显差异(P>0.05)，但水平运动指标显示在中剂量和高剂量组分别增加5.16%和14.79%；在中剂量和高剂量组中央区停留时间分别增加4.59%和72.95%，高剂量组明显增加(P<0.01)；穿越中央区次数分别增加8.58%和56.89%，高剂量组明显增加(P<0.05)。

表4 说明孕期给予高剂量营养补充剂具有明显提高雌性仔鼠(n=20)Table 4 Effect on autonomous activity of female filial mice(n=20)

对雄性仔鼠自主活动的影响见表5所列。与溶剂对照组比较，雄性仔鼠水平运动指标无明显差异(P>0.05)；垂直运动指标在中剂量和高剂量组明显增加(P<0.01和P<0.05)，分别增加47.06%和59.65%；在3个实验组中，中央区域停留时间及穿越中央区域次数均具有增加趋势，分别增加21.87%、26.44%、27.88%及37.27%、35.98%、10.40%，但无明显差异(P>0.05)。说明孕期给予中剂量和高剂量营养补充剂，具有明显提高雄性仔鼠对新鲜环境的好奇程度和探究行为的作用。

表5 对雄性仔鼠自主活动的影响(n=20)Table 5 Effect on autonomous activity of male filial mice (n=20)

3 讨论

微量元素(如钙、铁、锌、镁和铜)是人体必需的物质。孕期母体一种或多种物质摄入不足都将影响自身新陈代谢以及机体功能等，同时对胎儿的生长发育和成熟也将产生间接影响，导致胎儿发育障碍[7]。妊娠各个时期的胎儿生长发育有所不同，所需的微量元素和维生素也有所不同，所以按照不同阶段的需求给与一定的微量元素和维生素的补充是很有必要的[8]。

魏颖等[9]的研究显示，孕期孕鼠补充营养剂可增加孕鼠体质量，保证胚胎各主要器官如心脏、大脑、脊椎骨发育，另外有实验结果[10]显示孕期营养不良可影响胎儿重要器官发育，导致大脑结构和功能变化，进而表现为认知功能、学习记忆能力等方面永久性受损。本研究结果显示，孕期补充多种维生素和矿物质能够增加仔鼠出生、离乳和离乳一周体质量，说明在孕期给与母鼠多种维生素和矿物质补充剂能够促进仔鼠发育。

行为是观察到的动物对环境的反应，是对变化环境条件的适应活动。随着生活环境条件的改变或受到外界环境的刺激后，动物会在中枢神经系统控制下，做出一系列的行为反应(向性、趋性、反射、本能、学习和推理)[11]。旷场行为主要检测动物活动度及兴奋性、对新环境的探索、习惯化以及伴随的情绪变化[12]。本研究采用旷场实验方法，动态分析动物在旷场的活动轨迹，可以提取客观定量数据。该实验评价的指标包括实验动物的水平运动、垂直运动、中央区域停留时间及穿越中央区域次数等指标。水平运动的减少提示，大鼠活动度的降低，垂直运动的减少提示动物对新鲜环境的好奇程度降低。动物因对新鲜开阔环境的恐惧表现出主要在周边区域活动，中央区域活动减少的特性，但动物的探究行为又促使其向中央区域活动，因此中央区域活动时间及次数代表实验动物的探索行为[5]。陈贵海等[13]在对年龄及性别对小鼠新物体再认能力的研究中，发现老年雌性小鼠要比老年雄性小鼠有对新物体再认(短期记忆)能力下降。另外有研究显示[14-15]，适量补充维生素可提高机体的适应能力。本研究结果显示孕鼠添加营养补充剂对雌鼠水平运动和垂直运动影响不明显，但可增加其在中剂量和高剂量组中央区停留时间，分别增加4.59%和72.95%，高剂量组明显增加(P<0.01)；穿越中央区次数分别增加8.58%和56.89%，高剂量组明显增加(P<0.05)，说明孕期给予高剂量营养补充剂具有明显提高雌性仔鼠探索行为的作用，但在雄性仔鼠中，孕鼠添加营养补充剂可明显增加中剂量组和高剂量组垂直运动水平(P<0.01和P<0.05)；中央停留时间和穿越中央次数有增加的趋势，但没有统计学差异(P>0.05)，说明孕期给予中剂量和高剂量营养补充剂，具有明显提高雄性仔鼠对新鲜环境的好奇程度和探究行为。在对母鼠的研究结果中可以看到，断奶后一周母鼠的水平运动和垂直运动两项指标没有明显变化，但在中央区停留时间及穿越中央区次数两项分析指标有增加的趋势，分别增加33.02%和28.11%，提示孕期给予高剂量营养补充剂具有增加孕鼠产后探索行为的趋势；减小产后发生抑郁的可能性。

综合以上研究结果，与溶剂对照组相比，孕期添加营养补充剂具有增加产后孕鼠、仔鼠垂直运动及中央区域运动次数及时间的作用，而对实验动物的水平运动无明显影响，提示孕期营养补充剂能够在不增加实验动物自主活动的情况下，增加其探索行为。