应用COMT基因SNP位点鉴别拉布拉多和金毛猎犬胆量行为的研究

白 静 马雪娜 陈舒婷 雒 东 周子娟 王靖宇 王福金

(大连医科大学实验动物中心，大连 116044)

工作犬如导盲犬、警犬、军犬、搜索犬、侦缉犬等经过严格筛选和专业培训，一直活跃在国家各个职能部门协助社会工作，不可替代。在工作犬的培训过程中，高效的筛选方法对缩短培训时间、提高培训成功率有很好的辅助作用。

胆量在导盲犬、警犬等多种工作犬的筛选中都是十分重要的筛选指标[1]。由于胆小性情阻碍了犬与人类的正常交流，给人类使用导盲犬添加诸多障碍，因而成为导致导盲犬在培训过程中被淘汰的主要因素之一[2-5]。警犬的工作内容往往具有一些挑战性，需要犬有良好的环境适应能力、抗压能力等，因而胆量是警犬基本的警用素质。胆小性情具有显著的遗传特性[6]，因此，应用行为遗传学方法鉴别胆小性情的犬具有重要的理论价值和实际意义。

儿茶酚-O-甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase，COMT)位于细胞质内，广泛存在神经和非神经组织内。特别是，COMT还存在于神经胶质和突触后膜上，在单胺类神经递质的代谢中发挥重要作用，如多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素，并通过调节多巴胺的表达，影响人类的认知和大脑额叶功能[7]。已有研究表明，COMT与人类的认知、记忆、个性、焦虑行为，甚至精神疾病都有密切关系，也是相应治疗药物的作用靶标[8]。特别是许多研究已经显示人类COMT基因的几个SNP位点与人类恐惧和焦虑行为有显著的相关性，可作为胆量、焦虑及精神分裂症等相关行为鉴别的重要候选基因[9-10]。但是，目前并没有研究表明COMT基因SNP位点与犬的胆量行为具有相关性。因此，本研究通过qPCR-HRM方法检测犬COMT基因SNP位点的多态性，并分析其基因型及单倍型与犬胆量行为的相关性，旨在为工作犬的培训建立分子遗传标记。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1研究对象：选取中国导盲犬大连培训基地的118只犬作为研究对象：拉布拉多，91只，53雄38雌；金毛猎犬，27只，16雄11雌。犬的年龄均为12～24月龄。为了保证实验数据的准确性，选取的118只犬均具有明确的遗传背景并且处于相似的生活环境。

1.1.2主要试剂与仪器：血液DNA提取试剂盒(TaKaRa Code：D9081)； LightCycler® 480 High Resolution Melting Master 试剂盒(Roche)； PCR仪(Thermo)；电泳仪(百晶生物技术有限公司)；Gel DocTM EZ成像仪(Bio-Rad)；荧光定量PCR仪(LightCycler® 96 System，Roche)等。

1.2 方法

1.2.1DCA测试方法：犬胆量评估(dog courage assessment，DCA)是基于Svartberg等[11]所描述的 DMA 测试中的4个子测试(12个行为变量)评估犬胆量行为的方法：突然出现(恐惧、好奇、持续恐惧、持续兴趣)、金属响声(恐惧、好奇、持续恐惧、持续兴趣)、扮鬼(恐惧、好奇、接触)、枪声。主要对犬的惊吓反应进行观察，并依据标准化评分表[12]对犬的12个行为变量的反应强度进行评估，划分1～5个强度等级。通过构建的标准化评分表对子测试中行为变量的胆量强度得分进行等权相加，低分值对应低胆量强度，高分值对应高胆量强度。

1.2.2COMT基因SNP位点的选取：本文主要选取COMT的4个SNP位点(-1 666 bp C>G、c.39 A>G、c.216 G>A和c.482 G>A)进行基因型鉴定。-1 666 bp C>G位于COMT基因的上游调控区域，可能对基因的表达水平具有潜在影响；其余的3个SNP位点位于COMT基因的外显子区域，其中c.482 G>A为错义突变位点，可能对COMT基因的蛋白质结构功能产生影响；c.39 A>G和c.216 G>A为同义突变。

1.2.3HRM法鉴定基因型：高分辨率熔解曲线法(high resolution melting，HRM)是通过qPCR扩增过程中的熔解曲线的变化情况检测靶标基因序列变异的方法[13-14]。HRM具有高灵敏度，高通量，快速，低检测成本的优点[15-16]。以测序结果作为对照，我们对qPCR-HRM反应中的DNA模板量、引物退火温度、Mg2+浓度等条件进行了优化，使其达到对COMT基因的4个SNP位点多态性的最佳检测效果。具体优化条件为(20 μL反应体系)：模板DNA量(基因组DNA)为36 ng、Mg2+终浓度为2.5 mmol/L或3.0 mmol/L、引物浓度(PCR终浓度)为0.2 μmol/L。检测位点的引物及最优退火温度见表1所列。

表1 COMT基因SNP位点的引物序列及退火温度Table 1 Primer sequences and annealing temperature of the SNPs of COMT gene

1.3 统计方法

使用SPSS 19.0 分析品种、性别和年龄因素与胆量行为之间的相关性，多重比较分析SNP位点的基因型与胆量行为之间的相关性；使用PHASE 2.1软件对单倍型进行相关性分析；使用BioEdit v7.2.5软件分析每个位点的基因，使用LightCycler® 96 SW 1.1 software软件HRM检测法分析差异图和归一化熔融峰；使用GraphPad Prism 5软件中的双向ANOVA和Bonferroni事后检验进行整体分析。

2 结果

2.1 胆量行为与品种、性别及年龄间的关联性分析

结果显示(表2)，拉布拉多和金毛猎犬的品种、性别、年龄与胆量行为没有显著相关性(P>0.05)。

表2 胆量行为与品种、性别及年龄间的关联性分析Table 2 Correlation analysis between potential factors and scores of startled behavior

2.2 COMT基因SNP位点的基因型和基因频率检测

采用HRM法检测犬SNP位点基因型和基因频率，结果显示(表3)：①-1 666 bp C>G位点的基因型为CC、GG和CG，其中CC型的频率最高(87.3%)，C等位基因为优势等位基因(92.8%)；②c.216 G>A和c.482 G>A位点的基因型为GG、GA和AA，其中GG型的频率最高(70.3%和77.1%)，G等位基因为优势等位基因(83.9%和87.3%)；③c.39 A>G位点的基因型为GG、GA和AA，其中GG型的频率最高(42.4%)，A和G等位基因的频率相同(50%)。

表3 COMT基因SNP位点的等位基因频率及基因型频率Table 3 Allele frequency and genotype frequency of the four SNPs of COMT gene

2.3 胆量行为与COMT的SNP基因型的关联性分析

结果显示(表4)，4个SNP位点的基因型与胆量行为显著相关(P<0.01)。-1 666 bp C>G位点CC 与CG基因型之间与胆量行为的关联性存在显著差异(P<0.01)，而CC与GG基因型之间仅在扮鬼和枪声测试中与胆小行为存在显著差异(P<0.01)。c.39 A>G、c.216 G>A和c.482 G>A位点的主要等位基因纯合子GG型和其他基因型(GA和AA型)之间与胆量行为的关联性存在显著差异(P<0.01)。

表4 COMT的SNP基因型与犬胆量行为的关联性分析Table 4 The correlation analysis between SNP genotypes of COMT gene and scores of startled behavior of dogs

2.4 胆量行为和COMT的SNP单倍型的相关性分析

初步分析结果表明(图1)：犬COMT的SNP单倍型频率在4个子测试惊吓行为变量中的分布相一致。进一步采用GraphPad Prism 5软件中的双向ANOVA和Bonferroni事后检验进行整体分析的结果显示(图2)，CGAG(1121)(P<0.001)，CGGA(1112)(P<0.01)，CGAA(1122)(P<0.001)和 GGAA(2122)(P<0.001)是胆小犬的特征单倍型系统；CGGG(1111)(P<0.001)和CAGG(1211)(P<0.001)是非胆小犬的特征单倍型系统。其中，COMT基因的c.216 G>A和c.482 G>A位点的A等位基因在犬的胆怯行为上起主导作用。

图1 COMT的SNP单倍型频率在4个子测试惊吓行为变量中的分布注：**P<0.01，***P<0.001 Fig.1 Frequency of haplotype distributionin 4 sub-test startle behavior variablesNote: **P<0.01,***P<0.001

图2 COMT的SNP单倍型与惊吓行为变量的关联性分析注：**P<0.01，***P<0.001 Fig.2 Associations between startled behaviors of dogsand the haplotypes of the SNPs of COMT geneNote: **P<0.01,***P<0.001

3 讨论

虽然有研究表明，犬的COMT基因的SNP位点存在多态性并且可能与犬的行为相关[17]，但COMT基因SNP位点与犬胆小性情之间的相关性研究鲜有报道。本研究结果表明，COMT基因SNP位点的多态性与犬的胆小性情间存在显著相关性。COMT基因的3个SNP位点：-1 666 bp C>G、c.216 G>A和c.482 G>A的主要等位基因纯合子与高DCA评分(勇敢行为)密切相关，而杂合子或次要等位基因的纯合子与低DCA评分(胆小行为)相关。基因型频率分析也显示，主要等位基因的纯合子个体构成了测试犬的绝大多数，这意味着杂合子个体或具有次要等位基因的纯合子个体面临更强的选择压力。单倍型分析显示，CGAG、CGGA、CGAA和GGAA代表了胆小犬的特征单倍型系统。特别是c.216 G>A和c.482 G>A位点的A等位基因在犬的胆小行为中起主导作用。

已有大量文献表明，人类Val158Met(c.472 G>A)基因型与情感唤醒和情绪调节有关。特别是Met(A)等位基因与焦虑症相关，而Val(G)等位基因与积极的情绪密切相关[18-19]。我们的研究结果显示，c.482 G>A位点的Arg(G)等位基因与犬的高DCA分数(勇敢行为)密切相关，而Gln(A)等位基因与犬的低DCA分数(胆小行为)显著相关。有报道显示，人类和犬的COMT基因具有高度同源性(84%)，并推测人的Val158Met(c.472 G>A)与犬的c.482 G>A SNP位点可能具有相似功能[17]。这可能是因为人的Val158Met(c.472 G>A)与犬的c.482 G>A SNP位点位于相同功能区，并且都是错义突变位点，引起氨基酸的改变，从而影响COMT蛋白的功能，进而影响人类和犬的行为性状的表现。

另外，Lee等[20]研究发现，COMT基因的Ala72Ser(c.214 G>A)与人类的精神病和攻击行为有关，Ser等位基因是精神分裂症的危险基因。而犬的COMT基因的c.216 G>A位点的碱基恰好编码的是犬的72号位的蛋白。虽然犬的c.216 G>A是同义突变，但其与犬胆小性情具有显著相关性，表明该位点的多态性与COMT基因的功能密切相关。由于人类COMT基因具有多种功能，COMT可能不仅影响胆小性情，还会影响其他性情甚至精神障碍，因而，进一步阐明COMT在犬中的功能将为人类疾病的研究提供有价值的动物模型。

本研究主要以拉布拉多和金毛猎犬作为研究对象，并且样本量有限。为进一步确实COMT基因SNP位点的多态性与胆小性情的显著相关性，后期的研究应进一步扩大样本量，增加犬的品种。另外，还应考虑到各种神经递质相关基因之间的交互作用，以及基因与环境的交互作用，采用多基因及基因-环境设计的研究方法，从多方面多角度进行分析，探究COMT在神经系统中的重要作用，进一步为工作犬、宠物犬以及人类疾病的研究提供有价值的参考和启示。

特别值得注意的是，人为的遗传育种会导致许多先天性疾病，如心脏病、失明和耳聋等[21]，导致犬种质量的降低。虽然本研究结果显示了COMT基因SNP位点的多态性与拉布拉多和金毛猎犬胆小性情的显著相关性，可以作为鉴别胆小性情犬的理想遗传标记，但不应用于遗传育种，以免产生犬种品质下降的不良后果。再者，从进化角度来看，胆小作为一种警告信号，可以使机体免于危及生命或健康的危险行为，是进化的一种必然产物[3]。

综上所述，COMT基因的SNP位点与拉布拉多和金毛猎犬的胆小行为间存在显著相关性，揭示了COMT基因对犬的胆小性情具有重要影响，可作为早期鉴别犬胆小性情的有效的遗传分子标记，为降低工作犬的培训成本，提高培训成功率提供了一个有效的途径。