妊娠糖尿病大鼠造模方法研究进展*

江心泳 葛 莉 庞书勤 谢 勇 赖玉婷 黄萍萍 王冠东 陈 凡

(福建中医药大学，福州 350122)

妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)的发病率正逐年不断攀升[1]，全球发病率高达14%[2]。GDM不仅带来早产、巨大儿、胎儿畸形等诸多母儿的不良影响，而且也增加了母亲和其子代患代谢疾病的风险[1-3]。这些不良影响，引发了科研工作者对GDM研究的高度关注[4]。因此，研发符合人GDM病因和生理病理机制特点的动物模型成为一项重要课题。由于大鼠模型在糖尿病(diabetes mellitus，DM)相关研究中的广泛应用，参考资料丰富，并且具有孕期适中的特点，成熟期和生长期较其他实验常用哺乳动物如犬、羊、猪和灵长类动物短，适合观察孕期高血糖对胚胎及成熟个体的影响[5]，因此大鼠被广泛应用于GDM模型的研究中。目前，探讨GDM大鼠的造模方法主要有药物注射诱导、饮食诱导和药物注射联合饮食诱导三类，但各类造模方法所用药物和饮食剂量差别大。本文对大鼠GDM造模的文献进行综述，以期为以大鼠构建GDM模型的实验研究提供新的思考。

1 药物诱导GDM大鼠模型

1.1 链脲佐菌素注射诱导

链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)作为一种制备糖尿病动物模型的化学诱导剂被广泛应用于科研中[6]。其导致糖尿病的机制有两点：一是能通过葡萄糖转运蛋白2(glucose transporter-2, GLUT-2)被胰岛β细胞吸收，诱导其DNA的分裂和甲基化，抑制DNA合成，从而破坏胰岛β细胞而诱发糖尿病[7]；二是被STZ破坏的胰岛细胞可作为自身抗原触发炎症反应，扩大胰岛细胞损伤从而促使糖尿病的发生[8]。STZ是近年来动物模型实验诱导糖尿病发生的首选药物[9-10]。

在GDM大鼠模型构建上，STZ合适剂量的选择是建模成功的关键所在。蒋静等[11]在妊娠第6天禁食12 h后分组，一次性腹腔注射45 mg/kg和55 mg/kg STZ，以STZ注射72 h后空腹血糖≥16.7 mmol/L和尿糖 ++ 为成模标准[11]，其结果显示45 mg/kg STZ的成模率较高为95%，死亡率为5%，转阴率为10.52%。李佳等[12]在大鼠受孕当日禁食12 h后给三组大鼠分别注射35 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg STZ，以妊娠第4天空腹血糖>11.1 mmol/L作为成模标准，其结果显示40 mg/kg剂量的STZ成模率最高(83.3%)，死亡率最低(16.7%)。Zabrodina等[13]对妊娠当日一次性注射20、40、50、60、80 mg/kg STZ的大鼠进行了观察对比，结果显示20 mg/kg STZ未能改变血糖水平，40～80 mg/kg STZ能够使大鼠的血糖水平升高，60 mg/kg和80 mg/kg STZ诱导GDM大鼠模型的死亡率最高(90%)，50 mg/kg STZ诱导GDM大鼠的胎儿在妊娠第14天死亡率达50%，而40 mg/kg STZ在不增加胎儿死亡率的情况下，可以诱导大鼠血糖水平呈动态性增高。

1.2 四氧嘧啶注射诱导

四氧嘧啶(alloxan，ALX)是嘧啶的一种含氧衍生物，是胰岛β细胞毒性剂，ALX通过产生H2O2等超氧自由基选择性地破坏胰岛β细胞[14]，使其β细胞内DNA损伤，同时通过激活ADP核糖体合成酶活性，从而使辅酶Ⅰ含量下降，两者的共同作用使mRNA功能受损而引起细胞凋亡、减少，造成内分泌功能紊乱，糖、脂肪、蛋白质等的代谢失调而形成糖尿病[15-16]。

Aires等[17]在大鼠妊娠第8天空腹12 h后单次静脉注射37 mg/kg ALX，并以妊娠第10天血糖水平>200 mg/dL(即11.1 mmol/L)作为成模标准判断GDM成模，结果显示25只大鼠中有5只成模被纳入实验，成模率为20%。税迎春等[18]使用70 mg/kg ALX尾静脉注射诱导GMD大鼠，注射6 d后测量空腹血糖，以血糖值14～26 mmol/L判断为造模成功，同时行口服葡萄糖耐量试验和确认GDM大鼠模型血糖的变化。结果显示，同对照组相比，70 mg/kg剂量的ALX使大鼠空腹血糖值升高283.4%，且大鼠出现明显糖耐量异常。此外，Makni等[19]对6只妊娠第2天大鼠腹腔注射120 mg/kg的ALX诱导糖尿病，并口服葡萄糖溶液防止ALX造成的致命低血糖，在妊娠第3、7、20天采尾静脉血判断是否符合200～300 mg/dL(即11.1～16.7 mmol/L)的糖尿病标准，结果显示6只GDM组的大鼠血糖值均符合上述糖尿病标准。

1.3 雄激素注射诱导

女性体内糖脂代谢调控与雄激素受体(androgen receptor，AR)密切相关[20]，有研究表明雄激素水平过高的女性，可以出现糖脂代谢紊乱，胰岛素抵抗以及糖尿病等疾病[21]。雄激素对糖脂代谢的调控是通过与AR结合来实现[22-23]。Puttabyatappa等[24]研究表明，在实验环境中暴露于过量雄激素的大鼠会发生胰岛素抵抗，且妊娠期动物暴露于过量睾丸激素可能造成其代谢缺陷和不良妊娠结局[25]。

Areola等[26]研究使用丙酸睾酮进行造模并正常喂养，在大鼠妊娠第14天开始每天一次皮下注射0.5 mg/kg丙酸睾酮至妊娠第19天，并在妊娠第19天口服葡萄糖耐量试验(口服2 g/kg葡萄糖前以及口服后30、60、90、120 min分别取尾静脉血检测)。在处死当日禁食12 h后取血用于检测空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR)和胰岛β细胞功能(homeostasis model assessment-β，HOMA-β)，结果显示妊娠晚期母体内过量的睾酮可导致母体血糖升高，发生胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损而引发GDM。

2 饮食诱导

2.1 高脂饮食诱导

肥胖是GDM的易患因素[27]。妊娠期对糖类和脂类的摄入增加，若此时的饮食结构中脂类含量过高，导致脂肪在肝脏组织积累，而大量脂肪在肝脏的堆积是糖尿病发病的重要因素[28]，在引起妊娠期肥胖的同时也会引发GDM。饮食结构中高热量食物的过多摄入在引发肥胖的同时又促进了脂肪因子的分泌，而脂肪因子增多被认为是GDM发病因素之一[29]。

在高脂饮食诱发GDM的相关研究中，张馨文等[30]用含有60%脂肪热能的高脂饲料饲喂大鼠2个月后雌雄合笼，在妊娠第1、7、14、20天测量大鼠体质量和血糖变化，以及在妊娠第20天取血并行葡萄糖耐量试验(2 g/kg葡萄糖溶液腹腔注射后0、30、60、120 min分别取尾静脉血检测)，结果显示高脂饮食饲喂的大鼠在体质量、空腹血糖、C肽水平等指标上均高于普通饮食饲喂的大鼠，并出现糖耐量异常和胰岛素抵抗。Wu等[31]在大鼠妊娠后给予由40%碳水化合物、40%脂肪和20%的蛋白质构成的高脂饲料并观察高脂饮食对大鼠空腹血糖、胰岛素、口服葡萄糖耐量试验和胰岛素释放试验的影响，以探讨高脂饮食对妊娠大鼠胰岛功能的影响和机制，结果显示在高脂饮食的影响下，大鼠体质量、空腹血糖结果均有明显升高，而空腹胰岛素水平明显下降，且出现糖耐量下降和胰岛素抵抗，提示大鼠出现GDM。

2.2 高糖饮食诱导

Burgeiro等[32]的研究表明在饲喂高糖饲料后，大鼠会出现高胰岛素血症，胰岛素抵抗，高脂血症以及糖脂代谢受损等症状。在高糖饮食的作用下，胰岛细胞的空泡形成也随着糖浓度的增加而增加，从而造成胰岛细胞的损伤[33]。Zhang等[34]研究也证明了高蔗糖饮食会增加非糖尿病大鼠的胰腺损伤。

Zou等[35]采用含(63%果糖)的高糖饮食饲喂大鼠6周后妊娠，同时设置了未孕组给予相同饮食，观察果糖饮食对大鼠影响，并在妊娠第14天进行口服葡萄糖耐量测试，结果显示饲喂高果糖的妊娠大鼠出现葡萄糖耐受不良，而未孕大鼠则未出现葡萄糖耐受不良，这证明了果糖饮食会导致妊娠期大鼠的葡萄糖耐受不良从而形成GDM。Ozkan等[33]对3组妊娠期大鼠在妊娠期开始到妊娠一个月的时间内，每周5 d分别饲喂含10%、20%和30%蔗糖的水，对照组饲喂普通水，并通过检测饮水量、体质量、血糖、胰岛素水平和胰岛细胞的变化分析饲喂蔗糖对母鼠和子代的影响。虽然其结果显示各组大鼠均无糖尿病，但实验组的血糖、胰岛素水平明显高于对照组，且随着含糖量的增加而增加，在免疫组织化学检查与胰高血糖素免疫反应性检查中显示胰岛素受体和胰岛细胞数量减少，这表明高糖的摄入会对母体和子代的代谢平衡造成不良影响。

2.3 高脂高糖饮食诱导

高糖和高脂被认为是诱发GDM的重要因素，高脂高糖饮食通过诱发妊娠期大鼠胰岛素抵抗而形成GDM大鼠模型[36]。张婕等[37]研究发现，增加脂质与糖类的摄入，使其空腹胰岛素增加的同时，诱发实验动物出现肥胖，促使分泌较多的脂肪因子，使胰岛素生物学作用显著下降，引起了胰岛素作用的靶器官对胰岛素作用的敏感性降低，可诱导出胰岛素抵抗。

郭燕[38]使用含33%普通饲料、33%全脂、7%蔗糖和27%水的高脂高糖饲喂大鼠6周，通过妊娠后观察体质量、空腹血糖、妊娠第20天进行口服葡萄糖耐量测定以及妊娠第22天检测空腹血脂、胰岛素等值较对照组均明显升高为成模标准，结果显示高脂高糖饮食诱导的GDM大鼠相较于对照组出现了明显的糖耐量受损和胰岛素抵抗。此外，丰树焕[39]使用由20%蔗糖、1%胆酸钠、2.5%胆固醇、10%熟猪油及66.5%普通饲料组成的高脂高糖饲料饲喂大鼠8周后妊娠诱导GDM，结果显示高脂高糖组合笼一周后检测的血糖值≥6.7 mmol/L且葡萄糖耐量和血脂均高于普通饮食组，提示高脂高糖组孕鼠与人类GDM的病理状态类似。Vanzela等[40]研究了一种高脂高糖的自助餐式饮食饲喂大鼠14周，大鼠饮水上交替使用可口可乐和瓜拉纳南极洲两种软饮料，饲料采取由37.5%标准饲料、25%花生、25%巧克力、12.5%饼干制成的颗粒与蛋糕、威化等零食一起提供，总能量为4.41 kJ/g，该研究显示在自助餐饮食下大鼠体质量明显增加，糖耐量受损明显且出现胰岛素抵抗。

3 药物联合饮食诱导

3.1 STZ联合高脂饮食诱导

在STZ注射诱导前用高脂饮食饲喂大鼠造模。高脂饮食带来的体内高甘油三酯是脂肪酸利用和氧化率增加的一个来源，而脂肪酸利用和氧化会降低胰岛素介导的葡萄糖作用，降低糖的利用[41]，同时高脂饮食可诱导大鼠产生肥胖、脂质代谢紊乱和产生胰岛素抵抗，后期再用STZ静脉或腹腔注射，可造成胰岛β细胞凋亡或胰岛β细胞功能相对缺乏，从而抑制胰岛素的合成，使血糖升高[42]，二者相结合，可有效制备GDM大鼠模型。

黄长盛等[43]在菟丝子对GDM大鼠影响的研究中采用60%脂肪饮食饲喂大鼠8周并联合35 mg/kg剂量STZ构建GDM大鼠模型。实验采用60只大鼠进行模型制作，结果显示在以空腹血糖≥16.7 mmol/L为成模标准的情况下，有40只GDM大鼠被纳入后续实验，成模率为66.6%。此外，Liu等[44]的研究采取高脂饮食饲喂2周后联合腹腔注射60 mg/kg剂量STZ的方法构建GDM大鼠模型。该模型的高脂饲料由58%脂肪、25%蛋白质和17%碳水化合物构成，成模标准为STZ注射72 h后血糖高于16.67 mmol/L，结果显示造模的40只Wistar大鼠有13只成模，成模率为32.5%。

3.2 STZ联合高脂高糖饮食诱导

高脂高糖饲料喂养，可使大鼠体质量增加，导致肥胖。肥胖能够进一步导致胰岛素抵抗[29]，Farswan等[45]研究表明高脂高糖饮食可诱发葡萄糖耐量受损，使身体转向脂肪和蛋白质的分解和代谢，而同时通过小剂量STZ注射可损伤部分胰岛β细胞，抑制或减少胰岛素的分泌[46]，二者相互作用形成高血糖。

Abdel-Reheim等[47]以包含25%蔗糖、40%牛脂、20%酪蛋白的高脂高糖饮食饲喂大鼠5周，并在妊娠第7天时联合25 mg/kg剂量的STZ注射进行GDM大鼠的造模，结果同与先前实验进行的高脂高糖饮食联合20 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg STZ注射的造模情况进行对比后发现高脂高糖联合30 mg/kg和35 mg/kg STZ的大鼠体质量急剧下降，最终死亡，而20 mg/kg STZ并未引起明显高血糖，仅25 mg/kg STZ对大鼠的葡萄糖水平有显著影响。此外，李诗月等[48]通过以蔗糖15%、胆固醇4%、胆酸钠0.3%、蛋黄粉10%、猪油10%、基础膳食60.7%为配比制作高脂高糖饲料饲喂大鼠，4周后腹腔两次注射25 mg/kg STZ(中间间隔2 d)，2 d后大鼠可出现三多一少的症状，10 d后90%的大鼠血糖>16.65 mmol/L，即造模成功。汤梦雨等[49]将4种剂量的STZ(15 mg/kg、25 mg/kg、35 mg/kg、45 mg/kg)单次注射并联合高脂高糖饲料饲喂8周以探讨高脂饮食联合STZ构建GDM大鼠的方案。其高脂饲料由40%脂肪饲料构成，包括普通繁殖鼠料54.6%、猪油16.9%、蔗糖14%、酪蛋白10.2%、预混料2.1%及麦芽糊精2.2%。以注射STZ 3 d后检测空腹血糖值在6.67 ～16.67 mmol/L为成模标准，结果显示25 mg/kg STZ联合高脂饮食诱导的GDM大鼠模型成模率最高(62.5%)，死亡率最低(12.5%)。

4 成模标准

血糖是GDM诊断和检测的最基本指标，大多数研究都以空腹血糖作为糖尿病模型成立的观测指标，但判断标准却有所差异，成模指标为6.7～16.7 mmol/L[49]，如有研究[9，43]以大鼠空腹血糖≥16.7 mmol/L为建模成功，而有研究[39]以大鼠空腹血糖≥6.7 mmol/L为建模成功，具体成模标准见表1。王竹等[50]研究分析468例大鼠的空腹血糖和238例大鼠的餐后血糖数据，采用标准差、极差和半宽等方式对血糖分布误差进行评估，其结果指出大鼠的空腹血糖正常值范围在(3.95±1.31)mmol/L之间，餐后2 h血糖正常值范围在(5.65±1.63)mmol/L，并得出结论：当实验组大鼠的血糖值高于对照组2个标准差以上即可判断为血糖值升高，即空腹血糖>7.8 mmol/L或餐后2 h血糖>11.1 mmol/L时即可判断大鼠患糖尿病。但目前文献尚未发现针对正常孕期大鼠血糖值的大样本研究,而成模标准对GDM模型的建立至关重要，因此实验动物GDM建模的成模标准仍需进一步研究。

表1 不同造模方法的血糖成模标Table 1 Blood glucose modeling standards fordifferent modeling methods

5 结语

目前GDM的病因尚未完全明晰，动物实验作为基础研究的一种方法正广泛应用于GDM发病机制和治疗与护理研究中，并发挥着重要作用。综上所述，GDM大鼠的造模方法多，但尚未形成公认的造模方法，虽然已有文献针对造模方法中的不同剂量进行了探讨，但缺少统一的GDM大鼠成模标准和不同造模方法间的比较，以及分析大鼠活动量对GDM发生所造成的影响。所以，在未来GDM造模方法研究中需进一步依据人GDM发生发展机制，比较不同造模方法的优劣，形成一致的GDM大鼠成模标准，增加考虑妊娠大鼠活动量因素，开发出更加适用的GDM大鼠模型。