Th1/Th2细胞平衡及NK细胞对胚胎种植的影响

郭 玲，代彩凤，刘 金，李 莉，刘 雯，邓晓惠

(1.山东大学齐鲁医院妇产科不孕不育诊疗中心，济南 250012；2.山东大学医学院，济南 250000)

反复种植失败(repeated implantation failure，RIF)是指不孕症患者在经历多个体外受精(in vitro fertilization，IVF)或卵细胞浆内单精子注射(intra-cytoplasmic sperm injection，ICSI)周期并移植了多枚优质胚胎而未能发生胚胎种植或临床妊娠。目前国内外尚无统一的RIF诊断标准。Coughlan等[1]提出，40岁以下不孕患者在至少经历3个新鲜或冻融移植周期、累计至少移植4枚优质胚胎而未能实现临床妊娠即可诊断为RIF，此定义被采用率最高。RIF在IVF/ICSI助孕治疗中的发生率可达5%～10%[2]，给患者及家庭造成了巨大的经济损失和身心压力，是目前辅助生殖领域中亟待解决的一大难题。RIF病因繁多且复杂[3]，随着近年来生殖免疫学的发展，越来越多的研究表明RIF可能与母-胎免疫相关[4]。研究认为，辅助性T(Th)细胞及其分泌的细胞因子参与母体妊娠免疫耐受的形成[5]，Th1/Th2细胞平衡在胚胎种植和妊娠维持中发挥重要作用[6]，自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)对胚胎种植发挥着直接或间接的调节作用[7]。因此，外周血中Th1/Th2细胞平衡以及NK细胞亚群特征是近年来母-胎免疫平衡的研究重点及热点[8]。本研究通过研究黄体中期RIF患者与首次移植妊娠成功患者外周血中Th1、Th2型相关细胞因子及NK细胞表达差异，探讨Th1/Th2细胞平衡及NK细胞对胚胎种植的影响及调节机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2020年3月至2020年9月于山东大学齐鲁医院不孕不育诊疗中心就诊的35例RIF患者作为RIF组，同期采用IVF/ICSI助孕的首次移植即成功获得妊娠的29例患者作为对照组。本研究获得医院医学伦理委员会批准，患者均自愿参与本研究并签署知情同意书。RIF组患者纳入标准：(1)年龄<40岁且基础FSH<10U/L；(2)至少经历3个周期，新鲜或冻融移植周期累计至少移植4枚优质胚胎而未获得临床妊娠者。对照组纳入标准：(1)年龄<40岁且基础FSH<10U/L；(2)第1次于本院不孕不育诊疗中心行IVF/ICSI-ET助孕即成功获得妊娠的患者，且无不良孕产史。排除标准：(1)夫妻双方染色体异常；(2)女性生殖道解剖结构异常和病变；(3)甲状腺激素、血糖及胰岛素等内分泌检查异常；(4)凝血功能异常、血液高凝状态或遗传性易栓症；(5)子宫内膜息肉、盆腔积水、输卵管积水、子宫内膜炎等慢性盆腔炎性疾病等；(6)移植日子宫内膜厚度<7mm；(7)近3个月内无激素或免疫抑制剂类药物治疗史；(8)存在辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)及妊娠的禁忌证或合并其他对妊娠有重大影响疾病的患者。

1.2 研究方法

1.2.1 标本收集 受试者于行IVF/ICSI-ET治疗前的黄体中期(排卵后6～7天)，采集清晨空腹肘静脉血，-80℃冻存。

1.2.2 Th1、Th2型细胞因子检测 使用Aimplex流式多因子检测试剂盒(北京旷博公司)测定外周血中Th1、Th2型细胞因子浓度，包括白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-4与干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)，实验操作参考说明书。使用贝克曼-NAVIOS流式细胞仪进行检测。

1.2.3 NK细胞亚群的流式细胞术检测 60μl全血标本中加CD3-FITC/CD(16+56)-PE组合抗体(Beckman Coulter)与CD45-PC5抗体(Beckman Coulter)各5μl，室温避光反应15min。加溶血素室温避光反应10min，加固定液重悬细胞，在贝克曼-NAVIOS流式细胞仪上检测。

2 结 果

2.1 一般资料比较 RIF组与对照组患者的平均年龄比较，差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者的体质量指数(body mass index,BMI)、抗缪勒管激素(Anti-Müllerian Hormone,AMH)、基础内分泌和甲功三项等指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 对照组与RIF组患者的一般资料

2.2 外周血中Th1、Th2型细胞因子水平比较 RIF组血清中IL-6高于对照组，IL-10低于对照组(P<0.05)，差异有统计学意义。RIF组血清中IL-2、IL-4、IFN-γ含量高于对照组，TNF-α低于对照组，但差异无统计学意义(表2)。

表2 对照组与RIF组患者细胞因子水平比较(pg/ml)

2.3 Th1、Th2型细胞因子测定结果比值比较 两组患者血清中IL-2/IL-10、IFN-γ/IL-10和TNF-α/IL-10比值比较，差异均有统计学意义(表3)。

表3 对照组与RIF组患者相关细胞因子比值比较

2.4 NK细胞百分比比较 RIF组与对照组黄体中期外周血中NK细胞比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。

图1 RIF组与对照组NK细胞比例

3 讨 论

胚胎着床是一个步骤繁杂且易受多个因素影响的过程，包括定位、黏附、植入等多个阶段，任何步骤出现问题都有着床失败的可能。胚胎作为一种同种半异体抗原[9]，其成功种植关键在于母胎界面的免疫耐受，此过程有赖于免疫系统的调节，若免疫微环境发生免疫失衡，将导致胚胎着床失败或流产，而其具体机制目前尚不明确。在“种植窗口期”[10](排卵后6～7天)，外周血免疫细胞及相关细胞因子在母-胎交流和母体重塑方面发挥着重要的作用，但其在RIF患者及首次行IVF-ET助孕治疗即成功妊娠患者外周血中的表达差异仍有待进一步研究。本研究选取了在胚胎着床过程中具有重要作用的6种Th1、Th2型细胞因子以及NK细胞作为研究对象，通过检测其在“种植窗口期”外周血中的表达差异，初步探讨Th1/Th2细胞平衡及NK细胞对胚胎种植的影响及调节机制。辅助性T(Th)细胞在母胎免疫调节中发挥着重要作用，参与了RIF的发病机制[11]，根据自身分泌的细胞因子不同分为Th1、Th2及Th17细胞等[12]。Th1细胞主要分泌白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)、干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等细胞因子，介导细胞免疫和炎症反应。Th2细胞分泌IL-4、IL-6和IL-10等，参与体液免疫反应[13]。外周血Th1/Th2平衡对于成功的胚胎种植及妊娠维持非常重要[6,14]，可作为种植免疫状态的一个有效标记。目前针对Th1/Th2平衡对妊娠影响的研究多集中于动物实验或子宫局部等，而女性外周血中Th1、Th2的变化及其意义尚不明确，仍缺乏大样本的临床研究资料。Liang等[15]研究发现，与第1次行IVF/ICSI-ET助孕即成功妊娠的不孕症患者相比，RIF患者外周血中促炎细胞因子IFN-γ、IL-1β和IL-6水平升高，并且IFN-γ/IL-4、IFN-γ/IL-10和IL-6/IL-10比值显著升高，提示外周血Th1/Th2失衡可能与RIF发生相关。

本研究结果显示，RIF组患者外周血中促炎性细胞因子IL-6及IL-2/IL-10、IFN-γ/IL-10和TNF-α/IL-10比值明显高于对照组，而抑炎性细胞因子IL-10水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。IL-6作为一种炎性细胞因子，主要由Th2细胞分泌，正常情况下可激活基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)，并参与调节多种细胞因子、血管生成因子及某些重要酶的合成，对胚胎植入起到重要调节作用[16]。有研究发现，IL-6异常高表达常与不良妊娠相关[17],其具体机制尚不清楚，可能通过多种机制影响胚胎着床。IL-6过高可加强体液免疫反应，促进B细胞分化，通过促进抗体的产生加大NK细胞的自然杀伤能力[18]；也可诱导Th17细胞的分化，促进炎症反应，参与RIF的发生[19]。既往由于研究方法的限制，能同时检测出的Th细胞相关细胞因子数量有限，并且结果通常是以百分比的形式呈现。本研究通过流式细胞术微球阵列法对血浆中的相关细胞因子进行定量检测和分析，得出的结论与上述研究基本一致，RIF组总体趋势向于Th1型等具有促炎活性的细胞因子水平升高，而Th2型抑炎性细胞因子水平降低。

NK细胞是一种固有免疫细胞，表达特定的细胞表面标记物CD56，在人类外周血和子宫内膜中均存在，根据表达程度不同可分为CD56dim(低表达型)和CD56bright(高表达型)细胞亚群。大多数子宫NK(uNK)细胞表型为CD56brightCD16-，细胞毒性较低，通过分泌相关细胞因子，在胚胎植入早期直接或间接地发挥免疫调控作用[20-21]。外周血NK细胞约占外周血淋巴细胞的10%～15%[22]，主要表达CD56dim和CD16+，具有较高的细胞毒性，可通过复杂的免疫因子作用影响母胎对话造成胚胎着床失败[7]。目前NK细胞与RIF的相关性研究主要集中在uNK细胞，发现其在血管生成、胚胎发育及妊娠的建立等起到积极的作用[23]，而外周血中NK细胞水平与RIF关系的研究较少。有研究发现[24]，外周血中NK细胞可反应uNK的变化，并呈一定的相关性。另有研究发现，与正常妊娠女性相比，RIF患者外周血中NK细胞水平更高[25]。同时Fukui等[26]研究发现，RIF患者外周血NK细胞表达异常与Th1/Th2细胞因子免疫失衡相关。本研究结果表明，RIF组患者与对照组患者黄体中期外周血中NK细胞比例无明显统计学差异。考虑单一周期胚胎着床及机体免疫状态受多种因素调控，这可能与本研究样本量偏小有关，未来尚需更多大样本前瞻性的研究来加以论证。

综上所述，IL-6、IL-10可能参与种植窗口期外周血中Th1/Th2细胞平衡调节，从而影响胚胎种植。本研究结果为RIF致病原因评估开拓新的思路，为临床干预治疗提供依据和指导。