血清miR-222、HE4及CA125水平联合ROMA指数对上皮性卵巢癌的诊断价值

邓森灵，兰代群，曹雅文，符春丽，韩雪茹，苏红娥，闫志强

(海南西部中心医院妇产科，那大 571799)

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是临床常见的妇科恶性肿瘤，其早期临床症状不典型，病情进展迅速，预后较差，对女性的生命健康构成极大的威胁[1-2]。近年研究发现，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类长度21～25nt的非编码小分子RNA，参与细胞增殖、分化、凋亡和新陈代谢等过程，在EOC的发生发展中起到重要的作用[3-4]。研究指出，EOC患者存在miR-222的异常表达，其通过调控多种信号通路参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，可能与EOC发病过程有关[5]。人附睾蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)是一种小分子分泌性蛋白，在正常者及良性肿瘤中呈低表达，而在EOC中呈高表达，对EOC诊断具有重要价值[6]。糖类抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)是临床上常用于EOC诊断的肿瘤标记物，其在EOC中存在高度表达，对EOC的诊断、化疗监测及预后评估具有参考意义[7]。卵巢癌风险预测模型(risk of ovarian malignancy algorithm，ROMA)是通过结合患者绝经情况，并依据血清HE4和CA125水平，建立回归模型计算出预测指数，可用于评估卵巢癌的发生风险[8]。本研究通过检测EOC患者血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指数，分析其诊断EOC的临床价值，旨在为EOC的诊疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年1月1日至2019年12月31日海南西部中心医院收治的EOC患者120例，年龄34～75岁，平均(55.63±10.72)岁。纳入标准：(1)符合国际妇产科联合会(FIGO)分类标准和WHO分级标准，且经病理确诊为EOC；(2)患者在术前采血，未经手术治疗或未行新辅助化疗者；(3)能配合本次研究及病历资料完整者。排除合并其他恶性肿瘤及自身免疫疾病者。另取同期上皮性卵巢良性肿瘤患者100例(卵巢囊肿53例、卵巢浆液性囊腺瘤10例、卵巢黏液性囊腺瘤16例、卵巢畸胎瘤21例)为良性组和正常健康女性60例为对照组。本研究经医院伦理委员会批准，并与患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 miR-222检测 采集空腹静脉血5ml，3500r/min离心10min，分离血清，加1ml miRNeasy试剂。按总miRNA快速提取试剂盒(miRNeasy血浆提取试剂盒)说明书提取总miRNA。在ABI 7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)上进行实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)。以U6为实验内参，逆转录总反应体系为15μl：5μl RNA模板，3μl U6及miRNA特异性茎环引物，0.15μl 100mmol/L脱氧核糖核苷酸(dNTPs)，1.00μl逆转录酶(50U/μl)，1.50μl 10×反转录缓冲液，0.19μl RNase抑制剂(20U/μl)，4.16μl双蒸水；条件设定：16℃ 30min、42℃ 30min、85℃ 5min。PCR总反应体系为20μl：1μl引物及探针Mix(20×)，10μl TaqMan通用混合物溶液(2×)，1.33μl反向转录脱氧核糖核酸，7.67μl双蒸馏水。扩增条件：95℃预变性10min、95℃变性15s、60℃复性60s进行45个循环。2-△△Ct法计算miR-222-3p相对表达水平，△Ct=Ct目的基因-CtU6。

1.2.2 HE4及CA125检测 采用罗氏E601电化学发光免疫分析仪及配套试剂，化学发光法测定血清HE4及CA125水平，HE4>150pmol/L为阳性，CA125>35U/ml为阳性，操作过程严格按试剂说明书及仪器操作规程进行。

1.2.3 ROMA指数计算 ROMA指数应用ROMA分析软件进行计算，绝经前预测指数(PI)=-12.0+2.38×LN(HE4)+0.0626×LN(CA125)；绝经后预测指数(PI)=-8.09+1.04×LN(HE4)+0.732×LN(CA125)。ROMA(%)=[exp(PI)×100]/[1+exp(PI)]，绝经前≥13.1%或绝经后≥27.7%提示高风险。

2 结 果

2.1 3组患者的一般资料比较 EOC组、良性组和对照组的一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组患者的一般临床资料比较

2.2 各组血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指数比较 EOC组的血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指数均明显高于良性组和对照组，差异均有统计学意义(P<0.001)；良性组与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。Ⅲ～Ⅳ期EOC患者的血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指数均明显高于Ⅰ～Ⅱ期，差异均有统计学意义(P<0.001)。见表2。

表2 各组血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指数比较

2.3 血清miR-222、HE4及CA125水平联合ROMA指数对EOC的诊断价值 血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指数诊断EOC的最佳截断值分别为1.21、193.62pmol/L、165.73U/ml、35.60%，四项联合诊断EOC的曲线下面积(0.970，95%CI：0.913～0.998)明显高于单项miR-222(0.838，95%CI：0.780～0.896)、HE4(0.853，95%CI：0.792～0.913)、CA125(0.794，95%CI：0.736～0.855)、ROMA指数(0.890，95%CI：0.830～0.951)及HE4+CA125(0.764，95%CI：0.802～0.924)，差异均有统计学意义P<0.05)，其敏感度和特异度为99.5%和88.2%。见表3。

表3 血清miR-222、HE4及CA125水平联合ROMA指数对EOC的诊断价值

2.4 EOC患者血清miR-222水平与HE4、CA125及ROMA指数的相关性 Pearson相关分析显示，EOC患者血清miR-222水平与HE4、CA125、ROMA指数均呈正相关(r=0.830，P<0.001；r=0.772，P<0.001；r=0.884，P<0.001)。见图1。

图1 EOC患者血清miR-222水平与HE4、CA125及ROMA指数的相关性

3 讨 论

EOC是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，其病死率居妇科恶性肿瘤首位，因其发病隐匿，缺乏有效的早期诊断方法，大多数患者就诊时已为晚期。因此，探索EOC有效的早期诊断指标对提高患者的生存率有重要的临床意义。miRNA是一种广泛存在于真核生物的非编码小RNA，参与EOC的发病过程，有望成为EOC早期诊断的潜在生物标记物[9-10]。Chatterjee等[11]研究发现，与乳腺正常成纤维细胞相比，miR-222在乳腺癌相关成纤维细胞中高表达，miR-222参与乳腺癌增殖和侵袭转移，在促进乳腺癌的进展中起关键作用。Parizadeh等[12]研究表明，miRNA存在于不同的组织和体液中，在癌变过程中miRNA表达发生改变，miRNA表达与卵巢癌患者预后有关，可作为卵巢癌预后评估的生物标记物。有研究认为，miRNA参与多种生物学过程，包括增殖、凋亡、耐药、转移，在卵巢癌的发病机制中起着重要作用，可能成为卵巢癌诊断、预后预测和治疗评估的生物标记物[13]。

本研究显示，EOC组的血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指数均明显高于良性组和对照组，而良性组与对照组比较，差异无统计学意义，提示EOC患者血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指数升高，其可能参与EOC的发病过程。冯艾等[14]研究显示，卵巢癌患者血清HE4、CA125水平及ROMA指数均高于良性肿瘤组和健康对照组，而良性组与健康对照组无显著差异。提示血清HE4、CA125水平及ROMA指数升高可能与卵巢癌发生有关。研究表明，miR-222在EOC中表达异常，促进了EOC的病情进展，可能成为EOC诊断及靶向治疗的生物标记物[15]。本研究中Ⅲ～Ⅳ期EOC患者血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指数均明显高于Ⅰ～Ⅱ期，提示血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指数升高可能与EOC进展有关，其高表达的EOC患者，病情进展较快。常文龙等[16]研究发现，卵巢癌患者的临床分期越高，血清HE4及CA125水平越高，HE4及CA125在卵巢癌病情进展中起到重要的作用。另有研究认为，miRNA表达水平与EOC的临床分期及预后密切相关，可能是EOC诊断及预后预测的新型生物学指标[17]。

本研究应用ROC曲线分析，结果显示miR-222对EOC诊断的特异度较高，但其敏感度较低，有一定的局限性；ROMA指数能更好地兼顾灵敏度和特异度，对EOC的诊断效能较好；血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指数四项联合诊断EOC的曲线下面积最大，其敏感度最高。相关分析显示，EOC患者血清miR-222水平与HE4、CA125及ROMA指数均呈正相关(P<0.001)，可见四者之间具有良好的相关性，四项联合检测有助于提高EOC的诊断效能。包媛媛等[18]研究显示，卵巢癌患者血清HE4、CA125水平及ROMA指数明显升高，HE4、CA125及ROMA指数三项联合比单项在诊断早期卵巢癌中的价值更高。Deb等[19]研究表明，血清miRNA表达水平上调与卵巢癌的发生发展有关，可能为卵巢癌的检测、诊断和治疗提供新的思路，在未来有较好的应用前景。

综上所述，EOC患者的血清miR-222、HE4及CA125水平明显升高，联合ROMA指数对EOC诊断具有较高的价值，同时也为EOC的早期筛查及早期发现提供帮助。但这些研究仍处于初步探索阶段，EOC的具体发病机制尚未明确，有待于在细胞、基因水平进行更深层次的研究。