消渴方基于CN/NFAT信号通路对2型糖尿病大鼠的干预效果研究

许梦君，郭 曌，陆芝兰

(湖南中医药高等专科学校附属第一医院，湖南 株洲 412000)

2型糖尿病多合并代谢综合征1个或者多个组分的临床表现，如血脂异常、高血压、肥胖症等，且随着我国社会经济的快速发展和生活方式的改变，我国2型糖尿病的发生率逐年升高，目前已经成为除恶性肿瘤、心脑血管疾病之外另一种严重威胁人群健康的慢性非传染性疾病[1-2]。目前临床上对于2型糖尿病多采用胰岛素、降糖类药物进行治疗，但效果并不理想，且患者长期用药有一定不良反应[3]。中医学将糖尿病归属为“消渴”范畴，大量文献研究认为中药干预有辅助降糖和稳定控制血糖作用，且较安全[4]。消渴方是治疗2型糖尿病的经典方，本研究基于钙调磷酸酶(CN)/活化T细胞因子(NFAT)信号通路，探讨了该方治疗2型糖尿病的可能作用机制，现将结果报道如下。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 45只清洁级Wistar大鼠，由中国医学科学院医学实验动物研究所提供，动物许可证号：SYXK(京)2019-0011，鼠龄(4.3±0.3)个月，体重(219.0±11.2)g。大鼠均在无病原菌的干净笼子里喂养，室温在(22.1±1.8)℃，相对湿度35%～40%，每天光照12 h，喂饮净化水，饲养时间为1周。

1.2主要试剂 链脲佐菌素(STZ，上海恒斐生物科技有限公司)；柠檬酸钠缓冲液(北京凯瑞基生物科技有限公司)；丙二醛(MDA)单克隆抗体(上海烜雅生物科技有限公司)；总超氧化物歧化酶(T-SOD)单克隆抗体(上海江莱生物科技有限公司)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体[西宝生物科技(上海)股份有限公司]；CN单克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；NFATc1单克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；Bax单克隆抗体[西宝生物科技(上海)股份有限公司]；PDX-1单克隆抗体(上海烜雅生物科技有限公司)；Bcl-2单克隆抗体(上海烜雅生物科技有限公司)。

1.3药物 消渴方组方：党参、麦冬、茯苓各10 g，知母、丹皮、泽泻各20 g，天花粉、生地、生山药、丹参各30 g，水煎后药液离心处理，取出杂质，浓缩至1 g/mL的水煎液，高温杀菌，4 ℃保存备用。

1.4分组、建模及干预 大鼠适应性喂养1周后随机分为正常组、模型组、消渴方组各15只，模型组、消渴方组大鼠使用高脂饲料连续喂养3周，分3次小剂量(35 mg/kg)腹腔注射STZ，正常组注射等体积的柠檬酸钠缓冲液；1周后测定模型组、消渴方组大鼠空腹血糖(FPG)，若FPG≥11.1 mmol/L为建模成功[5]。 建模成功后，消渴方组大鼠给予消渴方7.5 g/kg灌胃，正常组和模型组大鼠给予等体积生理盐水灌胃，均1次/d，连续灌胃15 d。

1.5样本采集 干预结束后取尾部静脉血3 mL,以离心半径为5 cm、转速3 000 r/min离心处理10 min，分离上层血清，-80 ℃保存，待用。随机选取各组中3只大鼠处死，迅速取胰腺组织，行病理组织学观察。选取各组中6只大鼠腹腔注射3.0% 的戊巴比妥80 mg/kg麻醉，迅速取胰腺组织，运用酶消化法采集大鼠胰岛β细胞，加入PBS制备成单细胞悬液，调整细胞数为1×106个/mL，用于胰岛β细胞生长活力、存活率、凋亡率检测。处死每组中剩余6只大鼠，迅速取胰腺组织，用于氧化应激损伤指标、CN/NFAT信号通路蛋白表达检测。

1.6观察指标及方法

1.6.1糖脂代谢、胰岛功能指标检测 采用Olympus AU2700全自动生化分析仪检测各组大鼠FPG、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平；采用酶联免疫吸附试验法检测空腹胰岛素(FINS)水平，采用胰岛β细胞功能指数(HBCI)、胰岛β细胞分泌功能指数(FBCI)评价胰岛功能，其中HBCI=20×FINS/(FPG-3.5)，FBCI=FINS/FPG。

1.6.2病理组织学观察 取大鼠胰腺组织，使用4%多聚甲醛固定，常温下使用15%的EDTA脱钙，脱水后进行石蜡包埋，制作3 μm的组织切片，之后行HE染色处理，使用光学显微镜观察大鼠胰腺组织病理变化。胰岛β细胞胰岛素分泌情况采用免疫组化SP法观察。

1.6.3胰腺组织中氧化应激损伤指标检测 采用酶联免疫吸附试验检测各组大鼠胰腺组织中氧化应激损伤指标MDA、T-SOD、TNF-α水平。

1.6.4胰岛β细胞生长活力、存活率、凋亡率检测将所分离的胰岛β细胞使用不用浓度DEHP作用24 h、48 h、72 h，在试验终止后加入20 μL MTT溶液，在37 ℃环境下进行孵育，孵育4 h后吸去上清液，使用PBS洗涤1次，加入150 μL DMSO做终止培养处理，振荡0.5 h后测定每孔OD值，计算胰岛β细胞存活率，重复进行3次，取平均值。使用TUNEL法检测大鼠胰岛β细胞凋亡率，在荧光显微镜下进行观察计数，之后计算胰岛β细胞凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数×100%，重复进行3次，取平均值。

1.6.5胰腺组织中CN/NFAT信号通路蛋白表达量检测 采用Western blot法检测：将采集到的标本研磨后加入蛋白缓冲液，进行常规蛋白提取，采取BCA法进行定量分析。50 μg的蛋白样品上样后SDS-PAGE电泳，通过蛋白电转到PVDF膜，使用5%的脱脂奶粉TBST中进行避光封闭1 h，洗涤之后加入一抗稀释溶液，在4 ℃的环境中过夜保存，洗涤后加入二抗稀释溶液，在温床中孵育1 h后再次洗涤，加入发光液ECL，曝光2～3次，取重叠值。使用软件分析蛋白条带灰度值，内参蛋白是GAPDH。

2 结 果

2.1各组大鼠糖脂代谢指标比较 模型组大鼠血清FPG、TC、TG、LDL-C水平均明显高于正常组(P均<0.05)，HDL-C水平明显低于正常组(P<0.05)； 消渴方组血清FPG、TC、TG、LDL-C水平均明显低于模型组(P均<0.05)，HDL-C水平明显高于模型组(P<0.05)。见表1。

2.2各组大鼠胰岛功能指标比较 模型组大鼠血清FINS、HBCI、FBCI均明显低于正常组(P均<0.05)，消渴方组均明显高于模型组(P均<0.05)。见表2。

2.3各组大鼠胰腺组织病理学表现 正常组大鼠胰岛组织形态、胰岛素分泌量均正常；模型组大鼠胰岛组织出现萎缩，细胞核显著减少，胰岛素分泌量显著减少；消渴方组大鼠胰岛组织形态与正常组大鼠胰岛组织形态相似，胰岛素分泌量增加。见图1及图2。

2.4各组大鼠胰腺组织中氧化应激损伤指标比较 模型组大鼠胰腺组织中MDA、TNF-α均明显高于正常组(P均<0.05)，消渴方组均明显低于模型组(P均<0.05)；模型组大鼠胰腺组织中T-SOD明显低于正常组(P<0.05)，消渴方组明显高于模型组(P<0.05)。见表3。

表1 各组大鼠糖脂代谢指标比较

表2 各组大鼠胰岛功能指标比较

2.5各组大鼠胰岛β细胞生长活力、存活率、凋亡率比较 模型组胰岛β细胞生长活力、存活率均明显低于正常组(P均<0.05)，凋亡率明显高于正常组(P<0.05)；消渴方组胰岛β细胞生长活力、存活率均明显高于模型组(P均<0.05)，凋亡率明显低于模型组(P<0.05)。见表4。

图1 各组大鼠胰腺组织HE染色表现(×400)

图2 各组大鼠胰岛β细胞胰岛素分泌量免疫组化染色表现(×400)

表3 各组大鼠胰腺组织中氧化应激损伤指标比较

2.6各组大鼠胰腺组织中CN/NFAT信号通路蛋白表达量比较 模型组胰腺组织中CN、NFATc1、Bax蛋白表达量均明显高于正常组(P均<0.05)，PDX-1、Bcl-2蛋白表达量均明显低于正常组(P均<0.05)；消渴方组胰腺组织中CN、NFATc1、Bax蛋白表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，PDX-1、Bcl-2蛋白表达量均明显高于模型组(P均<0.05)。见表5及图3。

表4 各组大鼠胰岛β细胞生长活力、存活率、凋亡率比较

表5 各组大鼠胰腺组织中CN/NFAT信号通路蛋白表达量比较

图3 各组大鼠胰腺组织中CN/NFAT信号通路蛋白表达情况

3 讨 论

2型糖尿病在中医学上属于“消渴病”的范畴，此病的发生与饮食不节、先天不足、情志失调、房劳过度等相关，其主要病机为燥热偏胜、阴津亏损，以燥热为标、阴虚为本，与机体五脏均相关，以肾最为主要，消渴为病，较为难愈，且随着病程延长，可引发其他疾病[6]。消渴方源于元代朱震亨《丹溪心法》，由党参、麦冬、茯苓、知母、丹皮、泽泻、天花粉、生地、生山药、丹参等组成，具有生津润燥、益气养阴的作用[7-8]。消渴方中生地滋阴生津、清热凉血，天花粉可生津止渴、行津液，知母生津润燥、清热泻火，麦冬清热解烦、养阴生津。刘雅凝[9]和陈文一等[10]采用消渴方加减治疗气滞血瘀型和热盛伤津证2型糖尿病均取得较好疗效，但并未明确其具体作用机制。本研究通过动物实验进行了探讨，以明确消渴方治疗糖尿病的作用机制。

2型糖尿病属于一种多基因遗传性疾病，其发病与胰岛素抵抗、胰岛素分泌不足有关，上述生理病理变化表现为胰岛β细胞功能异常和胰岛β细胞减少，而胰岛β细胞减少与其凋亡相关，且引发胰岛β细胞凋亡的原因包括线粒体功能障碍、氧化应激、内质网应激、糖脂毒性等[11-13]。本实验结果显示，与正常组比较，模型组大鼠血清FPG、TC、TG、LDL-C水平及胰腺组织中MDA、TNF-α和胰岛β细胞凋亡率均明显升高，血清HDL-C、FINS、HBCI、FBCI及胰腺组织中T-SOD和胰岛β细胞生长活力、存活率均明显降低；与模型组比较，消渴方组大鼠各指标均较模型组明显改善，且病理观察消渴方组大鼠胰岛组织形态与正常组相似，胰岛素分泌量增加。提示消渴方可改善2型糖尿病大鼠糖脂代谢及胰岛功能，减轻胰腺氧化应激损伤，促进大鼠胰岛β细胞再生分化成熟，抑制胰岛β细胞凋亡。

CN/NFAT信号通路中的CN属于一种唯一受Ca2+/钙调素活化的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，其氨基酸序列具有较高的同源性，在组织中广泛分布，其中以T淋巴细胞、神经组织细胞中分布最多，在胰腺β细胞、肝组织、肺组织、脾组织中均存在，可调节多种细胞功能[14-16]。NFAT具有广泛的生理功能，包括NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4、NFAT5等成员，NFATc是CN下游的重要调控作用靶点，在胰脏、心脏、神经、平滑肌等细胞中存在，可调节多种生物学过程[17-19]。研究发现，CN/NFAT信号通路可调控胰岛β细胞生物学行为[20]。本实验结果显示，模型组胰腺组织中CN、NFATc1、Bax蛋白表达量均明显高于正常组，PDX-1、Bcl-2蛋白表达量均明显低于正常组，消渴方组胰腺组织中各指标均较模型组明显改善，提示消渴方可能通过阻断CN/NFAT信号通路而发挥治疗治疗作用。

综上所述，消渴方可能通过阻断CN/NFAT信号通路而改善2型糖尿病大鼠胰岛功能，减轻胰腺氧化应激反应，促进胰岛β细胞再生分化成熟，抑制胰岛β细胞凋亡。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。