非桥粒芯糖蛋白抗体在寻常型天疱疮中的作用机制

谢志敏 沈旭成 戴向农 李青青 叶兴东

1广州市皮肤病防治所皮肤科，广州，510095；2广州医科大学皮肤病研究所皮肤科，广州，510095

寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris, PV)是一种慢性自身免疫性大疱性皮肤病。其发病机制为患者血循环中产生针对皮肤结构蛋白中的桥粒芯糖蛋白(desmoglein，Dsg)1和Dsg3的自身抗体，当自身抗体与抗原结合时，发生细胞连级反应，引起桥粒结构发生改变，导致细胞间黏附丧失和表皮内水疱形成。然而，通过直接或间接免疫荧光检测到抗角质形成细胞(keratinocyte，KC)抗体的PV患者中，有10%～15%的患者抗Dsg1/3 ELISA检测为阴性[1]。将抗Dsg1/3自身抗体检测阴性的PV患者血清注射新生小鼠后也会出现棘层松解及水疱形成[2]。所以单凭Dsg1和Dsg3自身抗体不足以完全解释天疱疮中细胞间黏附丧失的机制。

在PV患者中，已经发现了许多针对桥粒其他结构和代谢蛋白的非Dsg自身抗体，如桥粒胶蛋白(desmocollin，Dsc)1和Dsc3、乙酰胆碱受体、线粒体蛋白、甲状腺过氧化物酶、分泌途径Ca2+/Mn2+-ATP酶亚型1(secretory pathway Ca2+/Mn2+-ATPase isoform 1，SPCA1)、斑菲素蛋白(plakophilin，PKP)1和PKP3、斑珠蛋白(plakoglobin，PG)及桥粒斑蛋白(desmoplakin，DP)等。研究表明，这些非Dsg自身抗体在天疱疮发病的复杂过程中协同补充了抗Dsg自身抗体的经典作用。

本文旨在探讨非Dsg蛋白在PV发病机制中的作用以及其在PV的检测、靶向治疗中的重要意义。

1 桥粒胶蛋白(desmocollin, Dsc)

Dsc属于钙黏蛋白家族，是桥粒的重要组成部分，在细胞间黏附中起重要作用。Dsc3主要表达于基底层与基底上层，Dsc2在表皮基底层的表达较低，Dsc1主要表达于表皮上层，后者已被证实是IgA天疱疮的自身抗原[3]。抗Dsc3特异性抗体已被证实有致病性[4]，体外实验发现抗Dsc3抗体会导致KC的黏附丧失[5]。抗Dsc抗体在副肿瘤性天疱疮、疱疹样天疱疮和增殖型天疱疮患者中可被检出[6]。部分PV患者及非典型临床表现的PV患者中也发现了抗Dsc1、Dsc2和Dsc3抗体[7,8]。Lotti等[9]发现，注射Dsc3自身反应性脾细胞的Rag2基因缺失小鼠的鼻和面颊周围出现了红斑、糜烂、结痂及斑片状的毛发脱落。

近年来的研究表明，Dsg与Dsc之间的异质结合是桥粒连接的基本结构，Dsc和Dsg通过细胞最外层N末端的同质及异质性相互作用，介导相邻细胞中间丝之间的连接[10]。Ishii等[10]通过体外实验重组Dsg与Dsc的胞外域，发现抗Dsg抗体、PF-IgG及PV-IgG可以阻断Dsg与Dsc的结合。

Mindorf等[11]对126例有口腔病变的PV患者进行Dsc1、Dsc2、Dsc3抗体检测，仅有一例Dsg3阴性的患者检测出抗Dsc3-IgG抗体阳性。因此有学者认为抗Dsc抗体并非适合PV患者的常规检测，对于非典型临床表现或抗Dsg1/3抗体检测阴性的患者可以考虑进行抗Dsc抗体检测。

2 斑菲素蛋白(plakophilin，PKP)

PKP是桥粒黏附至关重要的蛋白，参与调节桥粒内钙黏蛋白的转化和信号转导，与其他桥粒间蛋白相互作用，促进桥粒钙黏蛋白与DP和角蛋白中间丝网络的连接。原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)显示缺乏PKP1及PKP3的KC在细胞边界处发现Dsg1和Dsg3的膜利用率和结合频率下降，而PKP1是Dsg3聚集所必须的[12]。

PKP3参与了DP簇团向膜的转移，并以Ras相关蛋白1(Ras-related protein 1,Rap1)依赖的方式稳定桥粒钙黏蛋白[13]。Cirillo等[14]研究发现，PV-IgG与KC结合30 min后PKP3以Src依赖方式被酪氨酸磷酸化，随后与Dsg3分离，最终部分被消耗，磷酸化的PKP3可能作为信号分子参与细胞的分离。PKP1的过表达可以增加桥粒长度，稳定并增强桥粒黏附，防止Dsg3和其他桥粒蛋白从细胞边缘丢失，并可预防PV-IgG处理的KC连接体超微结构的改变[15]。

3 斑珠蛋白(plakoglobin，PG)、桥粒斑蛋白(desmoplakin，DP)

PG和DP是桥粒内的接合蛋白，它们作为跨膜黏附分子起到固定中间丝细胞骨架的作用。PV自身抗体导致PG的聚集及耗竭，PG的缺失导致细胞内聚力的丧失和p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的活化及角蛋白回缩，PG通过调控p38MAPK活性来调节细胞内聚[16]。

Thomas等[17]通过短干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)改变DP的水平发现，DP的耗竭与异常肌动球蛋白网络连接和收缩力有关。DP在与PV-IgG共孵育后以蛋白酶C(protein kinase C，PKC)依赖的方式被磷酸化；而针对DP突变位点S2849G的绿色荧光蛋白载体的表达可阻止DP磷酸化，增强KC间黏附，改善自身抗体介导的角蛋白丝回缩，并增加PKC-α与活化C激酶1的PKC支架受体的联系[18]。除此之外，DP还跟Rac、p38MAPK及Wnt/β-catenin 等信号通路相关[19，20]。

4 乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor，AChR)

表皮KC同时表达烟碱乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)和毒蕈碱乙酰胆碱受体，这两种受体亚型共同起作用以维持细胞与细胞间的粘附。乙酰胆碱主要位于表皮的最下层，起到调节KC增殖、迁移以及细胞与细胞、细胞与底物黏附的作用。有85%～100%的PV及PF患者产生抗角质形成细胞AChR抗体[21]。

PV患者血清的抗毒蕈碱乙酰胆碱受体M3亚型(muscarinic acetylcholine receptor subtype M3，M3AR)抗体水平比健康对照组升高[21]。Chernyavsky等[1]在抗Dsg1/3抗体阴性的PV患者中发现免疫球蛋白自身抗体与M3AR及SPCA1协同诱导棘层分解的机制。抗M3AR抗体增加了p38MAPK及非受体酪氨酸激酶Src的活性[2]。nAChR在细胞表面及线粒体外膜上表达。有研究表明，在线粒体外膜上，PV-IgG可以特异性地与几种线粒体nAChR亚型结合，说明PV-IgG损害了这些受体的抗凋亡功能；而激活线粒体nAChR可以消除PV-IgG的促凋亡作用，减少细胞色素C(cytochrome c，Cyt C)释放，且呈剂量依赖性，提示对线粒体的保护可能是烟碱类激动剂在天疱疮中抗凋亡作用的新机制[22]。

多项研究发现抗Dsg3及抗AChR抗体与PV疾病严重程度显著相关，抗M3AR抗体滴度随着治疗而下降，M3AR滴度或许可以起到病情监测的作用[21，23]。体外实验发现毒蕈碱类及烟碱类拮抗剂增加KC的通透性，导致棘层松解，并扩大表皮细胞间隙；同时胆碱能激动剂能够逆转棘层松解[24]。提示胆碱能激动剂可能在天疱疮的治疗中起着重要作用。Chernyavsky等[2]发现单独的抗M3AR、抗Dsc3及抗SPCA1自身抗体并不能导致小鼠水疱形成，只是在角质形成细胞上的黏附能力出现不同程度的改变；抗M3AR自身免疫性抗体加强了抗SPCA1自身免疫性抗体的促凋亡作用。提示非Dsg自身抗体同时攻击不同的自身抗原，单独或者协同诱导激活不同的下游信号通路参与疾病的发生。

5 分泌途径Ca2+/Mn2+-ATP酶亚型1(secretory pathway Ca2+/Mn2+-ATPase isoform 1，SPCA1)

家族性良性慢性天疱疮(Hailey-Hailey disease)的患者中发现ATP2C1发生了突变，Ca2+-依赖的细胞内信号和细胞内Ca2+/Mn2+稳态的改变，导致表皮细胞黏附丧失，表现为PV皮肤病变的非免疫表型[25]。而由ATP2C1基因编码的SPCA1，已经在部分PV患者血清中发现[2]。体外实验发现抗SPCA1自身免疫性抗体可导致KC明显收缩[1]。抗SPCA1抗体增强细胞凋亡标记物细胞CytC跟半胱天冬酶(Caspase)9的活性，由抗SPCA1 抗体触发的促凋亡信号传导通路以线粒体为靶点[2]。

6 甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase，TPO)

在天疱疮患者及其亲属中发现自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease，AITD)的发病率最高，其次为类风湿性关节炎及1型糖尿病[26]，有学者认为PV跟AITD属于同一类自身免疫性疾病群[27]。

研究发现4%～40%的PV患者抗甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase，TPO)抗体阳性，而抗Dsg1/3抗体阴性患者的阳性率更高[27,28]。缺乏PV相关人类抗白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)DQB1*0503的抗TPO抗体阳性率高于携带的患者，但疾病的严重程度与抗TPO抗体水平无关[27]。抗TPO抗体影响KC内的信号通路，类似于抗Dsg3抗体结合后的信号通路改变[27]。

7 线粒体蛋白(mitochondrial protein)

线粒体是细胞能量的主要来源，线粒体功能障碍会导致KC凋亡。研究发现PV-IgG激活KC中的线粒体凋亡通路，表现为CytC的升高和caspase 9的激活[29]。PV患者产生的抗线粒体抗体(anti-mitochondrial antibodies，AMAs)破坏了电子传递链，导致内膜的电化学梯度损失，增加了活性氧自由基的产生，降低了KC对应激的反应能力[30，31]。AMAs与抗Dsg抗体协同诱导表皮棘细胞松解，对AMAs的吸附抑制了PV-IgG在体内和体外引起的棘层松解[32]。对264例PV患者及138名对照组的蛋白组学分析提示88%的PV患者至少有一种线粒体蛋白抗体[30]。越来越多的证据表明，米诺环素、烟酰胺、环孢素等保护线粒体的药物对PV患者有治疗作用。对线粒体功能保护可能是一种非免疫抑制的新疗法。

8 展望

总之，PV患者抗Dsc抗体、抗AChR抗体、抗SPAC1抗体、抗TPO抗体及抗线粒体抗体的滴度与患者病情密切相关，且治疗成功后滴度降低，其中抗AchR抗体与PV患者的相关性更强，而抗Dsc抗体的特异性更高。另外部分抗Dsg抗体阴性的PV患者发现上述抗体阳性，对这些抗体的检测是诊断不典型PV的一种方法。PV的常规治疗中免疫抑制剂可以减少抗体产生，而非免疫抑制剂因其增加细胞黏附、减少细胞凋亡，是PV治疗的新靶点。PKP、PG及DP等在稳定并增强桥粒黏附，固定中间丝细胞骨架等中有重要作用，线粒体蛋白有助于稳定KC细胞，通过促进PKP、PG及DP的表达以及保护线粒体功能可能是治疗天疱疮的潜在方法。