复方中草药对虹鳟生长和非特异性免疫功能的影响

王凡，李聪歌，马雅雯，刘飞，郑雅婷，葛晓源，李菁祎，张明远，牛艺霖，孟祥杰

（洛阳师范学院，河南 洛阳 471934）

虹鳟Oncorhynchus mykiss 肉质细嫩、味道鲜美、营养成分丰富，几乎不含胆固醇，具有加速病人伤口愈合、帮助术后患者身体恢复等优点[2]，是我国备受欢迎的主要的淡水冷水性养殖鱼类之一[1]。随着市场需求量的增大，高密度集约化人工养殖迅速兴起，而这种养殖模式易引起不同类型病原微生物疾病[3]。目前，最为有效的病害防治方式是使用抗生素。抗生素不会被水生生物彻底吸收，而通过食物链进入人体或者通过代谢进入水环境，威胁人类健康，污染水环境[4]。

中草药具有促生长、无药物残留、增强机体免疫、来源广泛等独特优势，通常被称为“天然抗生素”，作为添加剂应用到饲料产业上具有广阔的前景。鱼类养殖中应用中草药不仅能够预防治疗疾病，还能够保证水产品的质量安全。复方中草药把各种单一的不同中草药的药效有效结合起来，使预防和治疗发挥到最大效果[5]。研究表明，复方中草药添加剂能够促进鱼类生长、调控免疫力和抗病力[6-8]。

红枣、山药和黄芪是我国常见食用兼药用的中药药材。红枣在提高体内单核细胞吞噬功能的同时，还能保护肝脏、增强体力[9]；黄芪能够提高鱼类生长性能、免疫力和抗病毒等[10]；山药可以通过多方面来调节黄河鲤Cyprinus carpio 的免疫能力[11]。因此，本实验通过研究上述复合物添加剂对虹鳟生长和非特异性免疫相关指标的影响，旨在探讨复方中草药对虹鳟生长性能的影响和免疫调控的分子机制，为复方中草药在虹鳟养殖中合理应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验饲料

将20∶1 的红枣、黄芪和山药提取物（购自陕西森弗天然制品有限公司，每1000 g 的原材料提取出50 g 的产品，经过原料精选、粉碎、精细提取、过滤、浓缩、精制纯化、干燥、精微粉碎几个步骤）等比例混合成复合物，以质量分数分别为0%（对照组）、0.3%、0.6%和1.2%的比例加入到虹鳟基础饲料的配方中制成复合中草药饲料（表1），基础饲料中不含复方中草药，由此得到4 种实验饲料。称取饲料原料后粉碎，混匀后使用ZL-600 颗粒机制作直径1.5 mm 颗粒饲料，经24 h 阴干后放入-20℃冰箱中保存备用。

表1 虹鳟基础饲料配方Tab.1 Ingredient of basic feed in rainbow trout

1.1.2 实验动物

虹鳟购自四川省眉山市东坡区天贵水产养殖场，体长7.6～8.9 cm，于冷水鱼循环系统中的饲养缸（直径×高=1 m×1 m）中用基础饲料暂养14 d。冷水鱼循环系统实时监测水温、pH 和溶氧（DO）含量，每天定时、定点投饵3 次，记录投饲量及残饵量。暂养期间水温为11～15℃，pH（7.0±0.2），DO＞8 mg/L[12]。

1.2 方法

1.2.1 实验设计

取暂养后体态均匀、规格基本一致的健康虹鳟幼鱼分为4 组：对照组和3 组复合中草药组，即分别投喂含复方中草药0.3%、0.6%和1.2%的饲料，对照组投喂基础饲料。各组设3 个平行，每个平行放鱼30 尾，养殖56 d。按照鱼体质量的3%～4%投喂。试验开始前，每缸整体称重，实验过程中环境和饲料管理条件同暂养期。

1.2.2 样品的制备

投喂实验结束时，禁食24 h，每缸鱼整体称重，计算增重率和特定生长率。然后每个实验组取6 尾（每缸取2 尾）测量体长及体质量，用酒精棉将鱼体消毒，再用已经消毒处理过的注射器自尾静脉取血，置于离心管中，在室温下放置1 h，置于4℃冰箱中过夜，3 500 r/min 离心15 min，制得血清[12]。同时，解剖取脾脏和肝脏装在离心管中，称量肝脏和脾脏重量，计算肝脏和脾脏指数，然后把肝脏、脾脏和血清一起放置-80℃超低温冰箱保存备用。

增重率（WGR）（%）=100×（终末体质量-初始体质量）/初始体质量；

特定生长率（SGR）（%/d）=100×（ln 终末体质量-ln 初始体质量）/试验天数；

肝脏指数（LSI）（%）=（肝脏湿重/鱼体质量）×100；

脾脏指数（SSI）（%）=（脾脏湿重/鱼体质量）×100。

1.2.3 血清抗菌活力（AA）的测定[12]

将活化后的大肠杆菌（购自中国微生物菌种保藏中心）接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基内，在摇床中37℃震荡培养48 h，然后用0.1 mol/L、pH6.4的PBS 缓冲液洗涤2 次后，将大肠杆菌配成A570=0.3～0.5 的悬液。取300 μL 该悬液于96 孔酶标板孔内，冰浴，加入5 μL 待测上述血清样品，混匀，在酶标仪中570 nm 下测A0，然后将酶标板移入37℃恒温培养箱中放置30 min，取出后置冰浴中10 min 以终止反应，于酶标仪570 nm 下测吸光度（A）。

1.2.4 血清其他生化指标的测定

血清中溶菌酶（LYZ）性根据比浊法测定；总蛋白（TP）含量采用BCA 法测定，酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）活性和尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）含量均采用微量酶板法测定（南京建成生物工程研究所）。超氧化化物歧化酶（SOD）采用WST-8 法进行测定，其试剂盒购自碧云天生物技术公司。

血清中的补体3（C3）、补体4（C4）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素6（IL-6）含量采用酶联免疫（ELISA）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）和酶标仪进行测定。

1.3 数据分析

所有数据均以“平均值±标准差（Mean±SD）”表示采用SPSS 13.0 进行单因素方差分析，并利用Dunnett’s 法检验对照组与饲料添加剂组之间的差异，P＜0.05 表示该添加剂组与对照组差异显著，P＜0.01 表示该组与对照组差异极显著。

2 结果与分析

2.1 复方中草药添加剂对虹鳟生长和肝、脾脏指数的影响

由表2 可知，饲料中添加复方中草药组虹鳟的WGR 和SGR 有增大的趋势，但与对照组无显著差异（P＞0.05），对虹鳟的LSI 影响也不显著（P＞0.05）。饲料中添加0.6%的复方中草药时，虹鳟的SSI 显著性升高了0.21 倍（P＜0.05）。

2.2 复方中草药添加剂对虹鳟血清LYZ、AA 和SOD 活力的影响

与对照组相比较，复方中草药组虹鳟的LYZ、AA 和SOD 活力升高（表3），其中SOD 酶活力极显著升高（P＜0.01），且升高了1.02、3.15 和1.75 倍；0.3%和0.6%复方中草药的组LYZ 活力显著升高（P＜0.05），且依次升高了0.29 和0.24 倍；而0.6%和1.2%复方中草药组AA 与对照组相比较有升高，但差异不显著（P＞0.05）。

2.3 复方中草药添加剂对虹鳟的肝肾功能的影响

与对照组相比，复方中草药组的BUN、CREA含量和GPT、ALP 活性有降低趋势，GOT、ACP 活性和TP 含量有升高趋势（表4），其中CREA 含量和ALP 活性极显著降低（P＜0.01），依次降低了21.49%、47.26%、39.61%和41.25%、43.95%、51.73%；0.6%复方中草药组的BUN 极显著降低（P＜0.01），降低了26.10%；而0.6%和1.2%的复方中草药组的GPT 活性稍低于对照组，但差异不显著（P＞0.05），各剂量组的GOT 活性高于对照组水平，但差异不显著（P＞0.05）。复方中草药组的ACP 显著高于对照组，依次增高了0.67、1.49 和1.49 倍，0.6%和1.2%组的TP也显著高于对照组，依次增高了0.54 和0.74 倍。

2.4 复方中草药添加剂对虹鳟血清补体及细胞因子的影响

复方中草药对虹鳟血清的补体及细胞因子含量的影响见表5。由表5 可知：除了IL-6 之外，与对照组相比较，各浓度组都呈升高趋势，其中在0.6%组C3 和C4 含量极显著升高（P＜0.01），依次升高了0.79 和1.62 倍；0.3%和0.6%组TNAF-α 都呈显著性升高（P＜0.05，P＜0.01），依次升高了1.09 和1.70倍，而0.6%组和对照组IL-6 含量有轻微升高，但差异不显著（P＞0.05）。

表3 复方中草药对虹鳟血清LYZ、AA 和SOD 活力的影响Tab.3 Effects of Chinese herbal compound on LZM,AA and SOD activities in the serum of rainbow trout

表4 复方中草药添加剂对虹鳟肝肾功能的影响Tab.4 Effect of Chinese herbal compound on liver and kidney functions in the serum of rainbow trout

表5 复方中草药添加剂对虹鳟血清补体及细胞因子的影响Tab.5 Effect of Chinese herbal compound on complement and cytokines in the serum of rainbow trout

3 讨论

3.1 复方中草药添加剂对虹鳟生长、免疫器官指数和血清肝、肾功能的影响

中草药作为饲料添加剂在鱼类中应用的研究表明，黄芪和含有黄芪的复方中草药较好地提高了一些鱼类的生长性能[8,10-13]。也有研究发现，含有黄芪的复方中草药对大菱鲆Scophthalmus maximus 幼鱼生长性能无显著影响[7]。本研究发现，含有山药、红枣和黄芪提取物的复方中草药具有潜在的提高虹鳟生长的趋势，但与对照组差异不显著。

脾脏和肝脏中的淋巴组织是鱼类重要的免疫器官之一。中草药能加速免疫细胞的增殖、分化和成熟，促进免疫器官的发育，提高免疫活性。王宏权等[14]研究表明，0.1%牛膝多糖能显著提高草鱼Ctenopharyngodon idellus 脾脏的脏器指数；较高剂量组的黄芪多糖可以明显提高罗非鱼Oreochromis mossambicus 的免疫器官指数[15]。本研究中，复方中草药对虹鳟的肝脏指数影响不显著，0.6%添加剂组显著提高了虹鳟的脾脏指数，这说明基础饲料中添加含有红枣、山药和黄芪提取物的复方中草药可以提高虹鳟脾脏的生长发育及其免疫功能。

肝肾功能指标常被用来评价动物的健康、营养和对环境的适应情况。BUN 和CREA 常是衡量肾功能的两种主要指标，它们在某种程度上反映了肾小球的滤过功能[12]。本研究中，复方中草药能使虹鳟血清BUN 和CREA 含量降低，使CREA 含量极显著降低，这表明含有红枣、山药和黄芪提取物的复方种草药添加剂增强了虹鳟肾脏的机能。GPT 和GOT 通常是衡量肝功能的常用生化指标，肝细胞受到损伤时，它们通常会升高。本研究中，复方中草药添加剂对GPT 和GOT 活性影响不显著，这表明含有红枣、山药和黄芪提取物的复方中草药对虹鳟的肝功能影响不显著。血清中TP 的含量是机体吸收、合成和分解蛋白质的一个标志性指标，也是机体免疫水平的间接反应[14]。ACP 和ALP 是动物溶酶体酶的重要组成部分，在免疫反应中发挥重要作用。ACP被认为是高等动物体内巨噬细胞溶酶体的标志酶，直接用于磷酸基团的转移，参与能量的转化和信号转导，有助于磷酸二腺苷和磷酸三腺苷的合成，提高机体的非特异性免疫水平和营养代谢水平[16]。ALP 是一种重要的代谢调控酶，在碱性介质中可通过水解作用将表面带有磷酸酯的异物清除掉，同时参与钙、磷的代谢营养物质的吸收和利用，其活性的高低与动物的生长性能关系密切[17]。本研究发现，复方中草药提高了虹鳟血清中TP 含量和ACP活性，而降低了ALP 活性，表明含有红枣、山药和黄芪提取物的复方中草药通过提高血清TP 含量和ACP 活性增强了虹鳟的免疫机能。崔晓翠等[18]研究发现，槟榔、川楝子复方中草药既能提高大黄鱼Larimichthys crocea 血清中ACP 的含量，也能提高ALP 的含量。李思明等[19]研究芦笋、薄荷叶等复方种草药也能够同时提高中华绒螯蟹Eriocheir Sinensis 血清中ACP 和ALP 的含量。路晶晶等[7]研究发现，含有黄芪的复方中草药显著降低了大菱鲆血清中ALP 的含量。以上研究表明，不同的复方中草药对水生动物的ALP 的影响机制不一样，黄芪可能在对ALP 的调控中发挥重要作用。复方中草药通过ALP 来调控鱼类免疫的机制还有待进一步去探讨。

3.2 复方中草药添加剂对虹鳟非特异性免疫指标的影响

LZM可以溶解细菌的细胞壁，调节其他免疫因子的合成与分泌，也能促进动物体内有益菌增殖。它的活性和抗菌活力直接关系到鱼类的免疫与健康[20]。SOD 是机体内天然存在的一种清除超氧自由基的抗氧化酶，其活性与生物的免疫水平密切相关[12]。本研究中，复方中草药能使虹鳟血清的LZM和SOD显著升高，0.6%和1.2%复方中草药组抗菌活力也略高于对照组。张意敏等[6]发现，含有黄芪的复方中草药能够显著提高罗非鱼血清的LZM 和SOD 活力。这表明复方中草促进了LZM和SOD 的生物合成，提高了鱼体的LZM和SOD 活力，增强了鱼体的抗病力与免疫力。

补体系统在先天性免疫中具有趋化、调理和消灭病原体的作用[21-23]。C3 和C4 是补体系统中重要的分子，C3 在补体系统中比例最高。C3 和C4 在机体防御中通过免疫复合物、调节吞噬细胞等清除病原微生物，活化炎症细胞[24]。本研究发现，复方中草药组虹鳟血清C3 和C4 含量有升高的趋势，0.6%剂量组升高显著，提高了虹鳟的免疫力和抗病力。陈成勋等[25]发现，黄芪多糖可以提高石斑鱼Epinephelus malabaricus 血清的C3 和C4 含量。Musthaf 等[26]发现，添加一定剂量南瓜子喂养莫桑比克罗非鱼Oreochromis mossambicus 4 周，补体活性显著增高。这些研究进一步说明了中草药通过增加补体的表达与分泌而明显促进鱼类先天免疫反应。

鱼类体内大部分细胞因子，特别是促炎细胞因子（包括TNF-α 和IL-6 等），都与细菌、病毒、炎症或细胞增殖以及趋化作用有关。TNF-α 是巨噬细胞受到病原体等有害刺激产生的一种小分子蛋白。它能直接杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞无明显毒性，是炎症反应必须的介质和多效性的免疫调节因子[24]。机体中有足够的IL-6 可以提高自身免疫功能[25]。本研究中，0.3%和0.6%的复方添加剂组可以显著提高虹鳟血清中的TNAF-α 水平。0.6%复方添加剂也使血清中的IL-6 水平有小幅度提高。这些结果表明复方中草药促进促了炎症因子表达与分泌，增强了虹鳟的免疫功能。

3.3 结论

本研究结果表明，在虹鳟饲料中添加适量的复方中草药添加剂（20∶1 的红枣、山药和黄芪的提取物等比例混合），可以促进脾脏的生长发育，提高虹鳟血清TP、C3、C4 和TNF-α 的含量及SOD、LZM和ACP 活性，提高虹鳟的免疫功能。建议虹鳟饲料的复方中草药的添加水平为0.6%。