温度和pH 对翘嘴红鲌消化酶活性的影响

韩庆，凌卯梅，龚丽军，赵莉，谢中国，杨品红

（湖南文理学院生命与环境科学学院，湖南 常德 415000）

翘嘴红鲌Erythroculter ilishaeformis，又名翘嘴巴、翘鲌子、鲌鱼，属于鲤科、红鲌属，具有很高的经济价值[1]。人工辅助鱼类繁殖技术的不断发展和配合饵料的成功开发，翘嘴红鲌的养殖面积在不断扩大，并成为人工养殖鱼类的重点对象。体外消化率和消化道生理特征的研究发现，翘嘴红鲌与典型的肉食性鱼类体型相近，但翘嘴红鲌的口裂小于典型的肉食性鱼类[2]。消化酶是消化腺分泌的一种消化分解摄入食物的酶，消化酶对鱼类的生长、发育和生命活动的调节具有重要的作用[3]。国内外有关鱼类消化酶的研究较多[4-14]。如对翘嘴红鲌不同消化部位主要消化酶活力[1]、不同温度下翘嘴红鲌幼鱼脂肪酶的活性[2]、湖泊中4 种野生鲌消化酶活性[15]及饲料中不同蛋白水平[16]和脂肪含量[17]对其消化酶活性的影响等进行了研究。有关温度和pH 对翘嘴红鲌消化酶活性影响的系统研究还未见报道。本实验通过研究在不同温度和pH 下翘嘴红鲌主要消化酶活性的变化，以期为翘嘴红鲌饲料开发及合理投喂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

自西洞庭毡帽湖养殖基地随机取游泳活泼、无病无伤的翘嘴红鲌6 尾，鱼体长25.50～31.00 cm，体质量248.50～285.37g。

1.2 方法

将活鱼放置在冰盘上快速解剖，取肝胰脏、肠道并剔除附着物，用提前预冷过的生理盐水冲洗两次，然后用吸水纸吸去表面水分，将肠道切分为前肠、中肠和后肠：肠道的第一个回折点的前端是前肠、最后一个回折点的后端是后肠、中间的一段就是中肠[2]，加入体积大约是样品体积10 倍的提前预冷的缓冲液，在研钵中研磨匀浆，转入1.5 mL 的离心管中，用高速冷冻离心机（5417R 型）在0～4℃，20 000 r/min 条件下离心6 min[2]，上清液为粗酶液，密闭封装置于-20 ℃冰箱中冷冻保存备用，24 h 内测定完各消化酶活性。

温度及pH 梯度设定：采用恒温水浴锅调节温度，在25～50℃范围内，以5℃为幅度，共设定6 个梯度，对照温度100℃，在缓冲液pH 为7.4 的条件下，测定各温度下肝胰脏、前肠、中肠和后肠中各种消化酶的活性[4]。

pH 以0.4 为幅度，分别设定pH 为6.2、6.6、7.0、7.4、7.8，在28℃下，测定各pH 下肝胰脏、前肠、中肠和后肠各消化酶的活性，在相同的温度条件下，以酶在各pH 梯度下活性最高时的pH 作为其最适pH[15]。

1.3 酶活力测定

蛋白酶：参照文献[14]的方法测定蛋白酶活力。在反应试管中加入0.4 mL 1%酪蛋白溶液及1 mL酶液，反应10 min 后放入沸水中加热5 min，使酶失活，再加入3 mL 考马斯亮蓝染色液染色10 min，加入3.6 mL 缓冲液稀释后，于595 nm 处测定吸光值。以1 min 内底物酪蛋白被分解产生1 μg 酪氨酸所需要蛋白酶的量为1 个酶活力单位（IU）[13]。

淀粉酶：加入0.4 mg/mL 淀粉底物缓冲液0.05 mL，25℃水中预热，加入2 mL 酶液混匀，反应10 min，加入3 mL 缓冲液稀释，在660 nm 处测定吸光值。以1 min 内1 μg 淀粉被分解所需要的酶量为一个淀粉酶的活力单位（IU）[2]。

脂肪酶：加入460 μmol/L 的甘油三脂4 mL，水浴10 min，再加入酶液0.05 mL，混匀（轻拿轻放，不要用力震荡）后倒入比色皿中，在420 nm 处测定吸收值记为A1，然后立即将混合液倒回对应的试管中，放在相应温度中反应15 min，再测定一次吸光值记为A2。以1 min 内底物甘油三酯被分解产生1 mg 脂肪酸所需要的酶量为1 个脂肪酶的活力单位（IU）[18]。

1.4 数据处理与分析

用Excel 表格对测定数据进行分析处理及作图，用SPSS17.0 进行方差分析及差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 温度对翘嘴红鲌3 种消化酶活性的影响

不同温度条件下，翘嘴红鲌肝胰脏、前肠、中肠和后肠中蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活性见图1～图3。

由图1 可知，翘嘴红鲌不同部位蛋白酶活性均在45℃时最高，肝胰脏为275.36 IU、前肠为201.58 IU、中肠为166.24 IU、后肠为150.49 IU。肝胰脏中蛋白酶活性大于肠道各部位且有显著差异（P＜0.05）；肠道中蛋白酶活性由前向后逐渐降低，但各段间差异不显著（P＞0.05）。消化道不同部位蛋白酶活性随温度的变化趋势基本一致，肝胰脏蛋白酶活性45℃＞40℃＞35℃＞30℃、50℃＞25℃，其中45℃、40℃间及30℃与25℃间无显著差异（P＞0.05），其他各温度间差异显著（P＜0.05）；前肠45℃＞40℃＞50℃、35℃、30℃、25℃（P＜0.05）；中肠与后肠45℃＞40℃、35℃＞30℃、50℃、25℃（P＜0.05）。

图1 不同温度对翘嘴红鲌肠和肝胰脏蛋白酶活性的影响Fig.1 Effects of different temperatures on protease activities in intestine and hepatopancreas of Erythroculter ilishaeformis

由图2 可知，翘嘴红鲌不同部位淀粉酶活性达峰值时的温度不同：肝胰脏为30℃，而肠道为40℃；肝胰脏淀粉酶活性峰值为377.42 IU、前肠为145.37 IU、中肠为300.57 IU、后肠为159.39 IU，肝胰脏中最高，肠道由高至低依次为：中肠＞后肠＞前肠，3段间差异显著（P＜0.05），前肠与后肠间差异不显著（P＞0.05），肝胰脏显著高于中肠（P＜0.05）。不同部位同一温度下比较，25℃、30℃、35℃均为肝胰腺高于中肠（P＜0.05），中肠高于前肠和后肠（P＜0.05），前肠和后肠间差异不显著（P＞0.05）；40℃时肝胰腺和中肠显著高于前肠和后肠（P＜0.05），肝胰腺和中肠、前肠和后肠间差异不显著（P＞0.05）；45℃时前肠高于中肠、后肠（P＞0.05），前中后肠均显著高于肝胰腺（P＜0.05）；50℃时4 个部位间无显著差异（P＞0.05）。不同温度下淀粉酶的变化是：肝胰脏35℃＞40℃＞30℃＞25℃＞45℃、50℃（P＜0.05），前肠和后肠变化相似，均为40℃＞45℃、35℃、30℃＞25℃、50℃（P＜0.05），中肠40℃＞35℃＞30℃＞45℃＞25℃＞50℃（P＜0.05）。

由图3 可知，不同部位脂肪酶活性均在40℃时最高，肝胰脏中83.23 IU、前肠65.14 IU、中肠68.37 IU、后肠52.42 IU，肝胰脏中显著高于肠道中（P＜0.05）；中肠高于前肠，二者间无显著差异（P＞0.05），中肠、前肠显著大于后肠（P＜0.05）。不同部位同一温度下比较，25℃及35℃时，肝胰脏、前肠、中肠高于后肠（P＜0.05）；30℃时各部位间无显著差异（P＞0.05）；45℃、50℃时肝胰脏显著高于前肠、中肠和后肠（P＜0.05），肠道各部位间无显著差异（P＞0.05）。

图2 不同温度对翘嘴红鲌肠和肝胰脏淀粉酶活性的影响Fig.2 Effects of different temperatures on amylase activities in intestine and hepatopancreas of Erythroculter ilishaeformis

图3 不同温度对翘嘴红鲌肠和肝胰脏脂肪酶活性的影响Fig.3 Effects of different temperatures on lipase activities in intestine and hepatopancreas of Erythroculter ilishaeformis

在设定的25～50℃范围内，翘嘴红鲌3 种酶的活性都是随着温度升高呈现先上升后下降。翘嘴红鲌不同消化部位中蛋白酶活性的最适温度均为45℃、脂肪酶均为40℃。淀粉酶活性在肝胰脏和肠道中的最适温度不同，肝胰脏为30℃，而肠道为40℃。

2.2 pH 对翘嘴红鲌3 种消化酶活性的影响

不同pH 条件下翘嘴红鲌肝胰脏、前肠、中肠和后肠中3 种消化酶的活性见图4～图6。

由图4 可知，翘嘴红鲌不同部位蛋白酶活性随pH 的变化基本一致，肝胰脏蛋白酶活性在pH7.4时达最大值188.17 IU，表现为pH7.4＞pH7.8＞pH7.0＞pH6.6＞pH6.2，pH7.4 显著高于其他pH（P＜0.05），pH7.8、pH7.0 间无显著差异（P＞0.05），pH7.8、pH7.0显著高于pH 6.6（P＜0.05），pH6.6 显著高于pH6.2（P＜0.05）。肠道蛋白酶活性在pH7.0 时最大，前肠、中肠、后肠分别为74.32 IU、70.50 IU 和85.13 IU，前肠pH7.0＞pH7.4、pH6.6＞pH7.8、pH6.2（P＜0.05），中 肠 和 后 肠pH7.0 ＞pH6.6、pH 7.4、pH7.8 ＞pH6.2（P＜0.05）。从不同部位蛋白酶活性最高值比较表明，肝胰脏中最高，显著高于肠道各部位（P＜0.05），前肠和中肠相近，后肠大于前肠和中肠，3 段肠间差异不显著（P＞0.05）。同一pH 不同部位蛋白酶活性的差异与此一致。

图4 不同pH 对翘嘴红鲌肠和肝胰脏蛋白酶活性的影响Fig.4 Effects of different pH values on protease activities in intestine and hepatopancreas of Erythroculter ilishaeformis

由图5 可知，不同部位淀粉酶最适pH 均为7.0，其肝胰脏、前肠、中肠及后肠淀粉酶活性最高值分别为206.24 IU、107.32 IU、59.48 IU 和93.04 IU，肝胰脏中活性最高，前肠＞后肠＞中肠，各部位间差异显著（P＜0.05）。pH6.2、pH6.6 时肝胰脏显著高于前肠（P＜0.05），前肠显著高于中肠和后肠（P＜0.05），中肠和后肠间差异不显著（P＞0.05）。pH7.4和pH7.8 时，从高到低依次为肝胰腺、前肠、后肠、中肠，其中，pH7.4 时，肝胰腺、前肠＞后肠＞中肠（P＜0.05）；pH7.8 时，肝胰腺与前肠间、后肠与中肠间差异不显著（P＞0.05）。不同部位淀粉酶活性随pH 的变化趋势相同，均为先升后降。肝胰腺为pH7.0＞pH6.6 ＞pH7.4 ＞pH6.2（P ＜0.05），pH6.2 ＞pH7.8（P＞0.05）；前肠为pH7.0＞pH7.4＞pH6.6、pH7.8＞pH6.2（P＜0.05）；中肠pH7.0 显著高于其他pH（P＜0.05），其他pH 间无显著差异（P＞0.05）；后肠pH7.0＞pH7.8＞pH6.6、pH7.8、pH6.2（P＜0.05），pH6.6、pH 7.8、pH6.2 间差异不显著（P＞0.05）。

图5 不同pH 对翘嘴红鲌肠和肝胰脏淀粉酶活性的影响Fig.5 Effects of different pH values on amylase activities in intestine and hepatopancreas of Erythroculter ilishaeformis

由图6 可知，不同部位脂肪酶活性均在pH7.4时最高，肝胰脏、前肠、中肠及后肠分别为57.02 IU、17.35 IU、61.43 IU 和34.33 IU，中肠最高，肝胰脏次之，二者间差异不显著（P＞0.05），前肠和后肠较低，后肠高于前肠（P＜0.05），肝胰脏和中肠高于前肠和中肠（P＜0.05）。不同部位脂肪酶随pH 变化的趋势与蛋白酶及淀粉酶相似。肝胰腺pH7.4＞pH7.0、pH 7.8＞pH6.6＞pH6.2（P＜0.05），前肠pH7.4＞pH 7.0＞pH6.6＞pH7.8＞pH6.2（P＜0.05），中肠pH7.4＞pH7.0、pH7.8＞pH6.6＞pH6.2（P＜0.05），后肠pH7.4＞pH7.0＞pH6.6＞pH6.2、pH7.8（P＜0.05）。

图6 不同pH 对翘嘴红鲌肠和肝胰脏脂肪酶活性的影响Fig.6 Effects of different pH values on lipase activities in intestine and hepatopancreas of Erythroculter ilishaeformis

在设定的pH 范围内，最适合翘嘴红鲌肝胰脏、肠蛋白酶活性的pH 分别为7.4 和7.0，最适肝胰脏和肠道淀粉酶活性的pH 为7.0、脂肪酶pH7.4。

3 讨论

3.1 消化酶与鱼类食性的关系

鱼类的食性与消化生理密切相关，其消化道结构和消化能力与食性相适应[14]。正常情况下，肉食性和植食性鱼类的消化道结构和能力有显著差异，肉食性鱼类消化道长度较植食性鱼类短，需高蛋白食物，所以肉食性鱼类的消化道中蛋白酶活性高，而植食性鱼类需纤维素含量较高的食物，所以消化道的淀粉酶活性比较高[14]。韩庆等[19]研究洞庭湖鲇Silurus asotus 消化道各部位蛋白酶活性由高到低依次为：前肠、肝胰脏、中肠和后肠。本研究中翘嘴红鲌消化道各部位蛋白酶活性由高到低依次为：肝胰脏、前肠、中肠、后肠，与洞庭湖鲇稍有不同，其原因可能是鲇为有胃鱼类，肝胰脏分泌的为蛋白酶原，需激活才能具有酶活，因此活力弱，而较前肠低。本试验中翘嘴红鲌蛋白酶活性的变化趋势与公子小丑鱼Amphiprion ocellaris[12]、嘉陵江鲇[13,14]、驼背鲈Chromileptes altivelis[20]等肉食性鱼类相似，蛋白质主要在前肠和肝胰脏中消化，说明翘嘴红鲌为偏肉食性鱼类。在翘嘴红鲌养殖中，应适当提高饵料中蛋白质含量，以满足其对蛋白质的需要，从而促进翘嘴红鲌的生长，提高生产效益。

3.2 翘嘴红鲌消化酶与其他鱼类消化酶的比较

本试验结果显示，翘嘴红鲌不同消化部位中蛋白酶活性的最适温度均为45℃，脂肪酶均为40℃，淀粉酶肝胰脏为30℃而肠道为40℃；蛋白酶活性肝胰脏的最适pH 7.4、肠道最适pH7.0，淀粉酶活性最适pH 7.0，脂肪酶活性的最适pH 7.4。翘嘴红鲌各消化酶活性随温度和pH 的变化与公子小丑鱼[12]、嘉陵江鲇[13,14]、洞庭鲇[19]和驼背鲈[20]相近。杨婳等[21]研究黄金鲈Perca flavescens 消化酶活力的结果显示：黄金鲈肠道蛋白酶活性的最适温度为50℃，本研究中翘嘴红鲌肠道蛋白酶活性的最适温度为45℃，较黄金鲈低5℃，可能是因为黄金鲈是热带鱼类，更适应于高温环境。翘嘴红鲌各部位消化酶活性最适温度比一般水温要高，在养殖中可适当提高翘嘴红鲌的生活水温，有利于对各种食物的消化，提高产量。各部位消化酶活性最适pH 均为中性偏碱，其中脂肪酶活性及肝胰脏蛋白酶活性的最适pH7.4 偏碱性，这与翘嘴红鲌长期生活在弱碱性水域环境中相适应，在养殖中应控制水体pH7.0～7.4，以有利于其消化酶发挥作用，提高食物转化率。