烟草花叶病毒P54基因的原核表达与蛋白纯化

李 聪，田培洁，张 宇，张德咏,，刘 勇,，张松柏, *

（1. 湖南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125；2. 湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410120；3. 湖南省农业科学院植物保护研究所，湖南 长沙 410125）

0 引言

【研究意义】烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）属帚状病毒科（Vigaviridae）科烟草花叶病毒属 Tobamovirus病毒，可侵染36个科的400多种植物，每年给全世界农作物造成的经济损失估计1亿美元以上[1]。TMV的基因组为一条正义单链RNA，其基因组长度约6 400 bp，编码1个结构蛋白和2个非结构蛋白；其中TMV P183基因中，编码一个假定的P54基因[2]，其功能目前还鲜见报道。【前人研究进展】TMV基因组第一个核苷酸连有一个7Gppp的帽子结构，紧接着是一个含有69个核苷酸的非翻译前导序列，编码TMV复制所需的专一性复制酶。从启动子到第一个终止密码子可翻译为P126蛋白，P126蛋白的C端有类似于螺旋酶和甲基转移酶的基本结构[3]，其主要功能是参与TMV复制。然而仅有P126蛋白存在时，TMV不能完成复制，表明TMV还编码其他蛋白参与其基因组复制[2]。通读P126基因的终止密码子，可翻译为P183蛋白，P183蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶结构，在TMV侵染后20～30 min就能合成足量的该蛋白，参与TMV基因组RNA复制，而仅有P183蛋白存在时，TMV的复制效率非常低[2]。此外，在这个读通区域中有一个起始密码子和一个开放阅读框（ORF），编码了假定的P54蛋白，预测其功能与TMV的复制相关[4]，然而，P54蛋白的功能，尚无研究证实。【本研究切入点】为研究P54蛋白的功能，需要对P54蛋白进行原核表达并分离纯化，获得大量的P54蛋白。【拟解决的关键问题】研究表明，植物病毒编码的基因，在E coli中原核表达，通常以包涵体形式存在，包涵体蛋白的复性纯化是获得有活性纯化蛋白的技术难题[5]。本研究对包涵体进行复性，脱盐后进行分离纯化，以期获得纯化的P54重组蛋白，为P54蛋白的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

TMV侵染三生烟（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）叶片，本实验室保存；HiScript II One Step RT-PCR Kit（Dye Plus）购自南京诺唯赞生物科技公司；原核表达载体pEASY®-Blunt E1、大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受态细胞购于全式金试剂销售有限公司（长沙）；DNA凝胶纯化回收试剂盒购于OMEGA公司；蛋白纯化柱The Thermo Scientific™HisPur ™ Ni-NTA Spin Columns、一 抗6x-His Tag Monoclonal Antibody（HIS.H8）、二抗Goat anti-Mouse IgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary Antibody，HRP购自Thermo Fisher Scientific公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒构于北京索莱宝生物公司。

1.2 RNA抽提及RT-PCR

三生烟叶片总RNA抽提采用TrazoL法[6]。TMV P54基因的特异性RT-PCR扩增引物以TMV基因组（Genbank登录号：HE818438.1）为模板设计，添加双酶切位点（下划线）和保护碱基（TMV/rdrp/sacI/F：5′＞ACCGAGCTCATGCAGTTTTACTATGATAAGTG TC＜3′，TMV/rdrp/xhoI/R：5′＞CCCCTCGAGACAAC TAGAGCCATCTATAAACAA＜3′,）。

以抽提的感染TMV三生烟总RNA为模板，P54基因特异性引物采用一步法进行RT-PCR[7]，PCR产物于1%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物采用DNA凝胶纯化回收试剂盒（OMEGA公司）回收纯化。

1.3 重组原核表达载体构建

用PCR产物和pEASY®-Blunt E1，采用DNA凝胶纯化回收试剂盒（OMEGA公司）回收纯化PCR产物，将纯化回收后的PCR产物连接至pEASY®-Blunt E1中。将连接好的载体转化至E coli DH5α，以原核表达载体pEASY®- Blunt E1试剂盒自带T7引物进行PCR菌落鉴定，PCR产物委托北京擎科新业生物技术有限公司测序。

1.4 TMV P54基因的原核表达条件优化

将测序正确的重组质粒pEASY®-Blunt E1::P54转入E coli BL21（DE3）中，分别使用0.1、0.4、0.8和1.2 mmol·L−1异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-Dthiogalactoside，IPTG）于28、37 ℃培养4 h进行蛋白的表达及条件优化。吸取2 mL培养物，用高速低温离心机12 000 g，4 ℃，离心10 min收集菌体提取总蛋白。

1.5 原核表达蛋白提取纯化

将 菌 体 收 集 悬 浮 于 裂 解 缓 冲 液（50 mmol·L−1Tris-HCl，50 mmol·L−1NaCl，pH 8.0）中，超声破碎细胞（功率400 W，工作4 s，间歇4 s，共30 min）。破碎后菌液用高速低温离心机12 000 g，4 ℃，离心10 min，取上清20 μL，沉淀用1×PBS悬浮后取20 uL；上清液和悬浮后沉淀用于SDS-PAGE鉴定。包涵体蛋白纯化参照The Thermo Scientific™ HisPur™Ni-NTA Spin Columns操作说明进行，并将收集到的液体装入透析袋，于8、6、4、2、0 mol·L−1尿素的梯度透析液（5%甘油、1% L-精氨酸、2% 甘氨酸、1×PBS，pH 8.0）中，于各个梯度透析液中4 ℃下透析复性12 h以上，收集液用高速低温离心机12 000 g，4 ℃，离心10 min，保留上清，去除沉淀，纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE鉴定。

1.6 Western blotting检测

将纯化后的蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，转印到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，4 ℃一抗（6x-His Tag Monoclonal Antibody（HIS.H8）from Thermo Fisher Scientific）孵育过夜，清洗PVDF膜；于37 ℃进行二抗（Goat anti-Mouse IgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP from Thermo Fisher Scientific）孵育，清洗PVDF膜，用Thermo Scientific™ Pierce™ECL Plus Western Blotting Substrate显色试剂盒进行显色检测[8]。

2.1 原核表达载体的构建

以感染TMV三生烟的总RNA为模版，RT-PCR扩增TMV P54基因，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，PCR扩增得到1条大小约为1.5 kbp特异性条带（图1-A），纯化回收后测序结果表明，该条带大小为1 425 bp，与TMV P54基因的同源性高达100%。

图 1 原核表达载体p EASY®- Blunt E1::P54凝胶电泳分析Fig. 1 Electrophoresis of recombinant prokaryotic expressing plasmid, pEASY-Blunt E1::P54

将P54基因条带双酶切后，插入双酶切的pEASY®-Blunt E1，转化E coli BL21（DE3）。菌落PCR扩增得到了与预期大小一致的特异性条带（图1-B），表 明原核表达载体pEASY®-Blunt E1::P54构建成功。

2.2 P54基因的原核表达及蛋白鉴定

将含重组质粒pEASY®-Blunt E1::P54的E coli BL21（DE3），在37 ℃，0.5 mmol·L−1IPTG诱导4 h，分别取上清与沉淀，SDS-PAGE 检测结果表明，37 ℃，0.5 mmol L−1IPTG诱导4 h，在55～70 kDa出现特异性目的条带（图2），即重组P54蛋白，并且重组E1-P54蛋 白大部分表达于包涵体中。

2.3 P54原核表达条件的优化

为了探究P54蛋白原核表达的最优条件，对诱导条件进行优化。分别利用0.1、0.4、0.8、1.2 mmol·L−1IPTG于28、37 ℃培养4 h。SDS-PAGE 电泳显示（图3），在28、37 ℃时，大肠杆菌的上清蛋白中均未发现目的条带（泳道1～4，9～12）。在大肠杆菌的沉淀蛋白中出现了目的条带（泳道5～8，13～16），且在37 ℃下诱导的蛋白表达量高于在28 ℃；IPTG浓度超过0.4 mmol·L−1后，目的条带无明显变化；表明P54蛋白的最佳诱导温度与最佳IPTG浓度分 别为37 ℃、0.4 mmol L−1。

2.4 重组蛋白P54的纯化与蛋白浓度测定

重组P54蛋白包涵体经过过柱纯化，透析复性，SDS-PAGE结果表明，纯化蛋白在55～70 kDa出现了1条与预测大小一致特异的蛋白条带（图4）。纯化后的蛋白浓度测定参照索莱宝BCA试剂盒进行，制作标准曲线（y=0.46x+0.06, R2=0.94），计算纯 化后蛋白含量为0.29 mg· mL−1。

图 2 P54蛋白诱导表达产物SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis on induced expression products of P54

图 3 TMV P54基因表达条件优化（A：28 ℃，B：37 ℃）Fig. 3 SDS-PAGE analysis on prokaryotic expressing of TMV P54 (A: 28 ℃; B: 37 ℃)

2.5 P54重组蛋白的Western blot鉴定

纯化后的P54重组蛋白，采用6×His单克隆抗体进行Western blotting检测，结果表明，纯化后的重组P54蛋白，与6×His单克隆抗体与杂交条带，证 实纯化后的重组蛋白为P54重组蛋白（图5）。

3 讨论与结论

将TMV P54基因序列插入到原核表达载体pEASY-Blunt E1，在宿主菌E coli BL21（DE3）中进行诱导表达，TMV P54蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体复性后，透析复性后采用Ni-NTA柱层析纯化，SDS-PAGE及Western-blotting证实纯化得到了分子量大小约为60 kDa的P54重组蛋白，为大量表达P54蛋白，研究其生物学特性打下了基础。

图 4 纯化TMV P54重组蛋白SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis on purified TMV P54

图 5 纯化TMV P54重组蛋白Western blotting分析 Fig. 5 Western blot on purified TMV P54

TMV的基因组复制研究表明，TMV编码P183和P126蛋白，参与TMV的复制[9,10,11,12]，此外，TMV还编码一个假定的P54蛋白，预测其功能与TMV的复制相关[4]，但尚无相关研究证实。有研究表明受染植物细胞的多聚核糖体中，可以检测到P54基因的mRNA，却未检测到P54蛋白[13]。推测P54蛋白可能是一个特定时间表达蛋白，但目前尚无研究证实。因此，急需开展TMV编码P54蛋白功能研究，为研究明确TMV复制分子机制提供科学基础。

采用原核表达技术，纯化获得大量表达目标蛋白，是研究目标蛋白生物学功能的基础，影响外源蛋白原核表达水平及其生物活性的因素有多种，如目标蛋白自身编码基因、表达宿主菌以及诱导表达的条件等[14,15]。植物病毒编码蛋白的原核表达研究表明，原核表达的植物病毒编码蛋白，通常以包涵体形式存在[5]，本研究结果得到类似结果，P54蛋白以包涵体形式存在。此外，温度会显著影响原核蛋白的表达，在高温诱导时，大肠杆菌的生长速度较快，蛋白表达的速度会随之增快，导致表达的蛋白不能正确折叠，易形成包涵体[16,17]。在28 ℃和37 ℃，原核表达的P54蛋白均以包涵体的形式存在，表明P54蛋白形成包涵体，可能与蛋白的不能正确折叠无关，而与蛋白本身特性有关。

原核表达的蛋白包涵体，可复性恢复生物学活性[18]，本研究采用盐酸胍对P54重组蛋白进行复性，并透析浓缩去掉盐离子，获得了纯度和浓度均较高的重组蛋白，为后续深入研究烟草花叶病毒P54蛋白功能奠定基础。