衣原体疫苗的研究策略与进展

余南燕，向文静，周 洲

衣原体(Chlamydia)是一类专性胞内寄生的原核细胞型微生物，以二分裂的方式进行繁殖，具有独特的双相发育周期。其中，引起人类疾病的主要有沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis, Ct)、肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae, Cpn)和鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci, Cps)。Ct感染眼部可引起结膜炎、沙眼等疾病；感染男性泌尿道，引起尿道炎、前列腺炎和附睾炎；感染女性生殖道，容易发生子宫内膜炎、尿道炎并导致盆腔炎、输卵管性不孕、异位妊娠等严重并发症。目前有文献报道，Ct感染既可增加人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染机会，也可与人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)协同作用诱发宫颈癌变[1-2]。Cpn不仅造成呼吸系统感染，而且与冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病以及哮喘、多发性硬化症、阿尔兹海默症、反应性关节炎等多种慢性病相关。Cps是一种人兽共患病原体，传染性极高，通常呈全身性感染，主要表现为非典型性肺炎。研究表明，Cps是引起全球1%社区获得性肺炎的病原体[3]。总之，衣原体感染导致的疾病严重威胁着人类健康，给各国公共医疗卫生系统带来了巨大的经济负担。此外，长期或重复使用抗生素易产生耐药性[4]，增加衣原体反复感染后形成输卵管性不孕等严重并发症的风险。免疫接种不仅能预防个体感染，避免感染后引发严重的病理反应，而且能有效降低衣原体的传播速度。因此，迫切需要开发一种针对不同宿主、不同菌株的有效疫苗来预防衣原体感染，控制衣原体的传播、流行。

1 衣原体疫苗的研究策略

1956年，中国科学家汤飞凡等利用鸡胚接种的方法培养了眼型Ct[5]，随后Collier LH等将沙眼衣原体进行体外培养，模拟衣原体的自然感染，探索其免疫机制和致病机制[6-7]，开启衣原体疫苗研究的新征程。目前人类在衣原体免疫机制的研究和疫苗开发方面已经取得了一定的突破，研究表明，衣原体疫苗免疫接种的免疫效果受多种因素影响，如抗原能否诱导适当的免疫保护性；不同类型菌株之间的遗传差异；宿主的种类及状态；疫苗的运输和保存方式；免疫接种的最佳时机和免疫策略等[8]。但是目前仍然没有成功研制出对人类有效的衣原体疫苗。

因此，合理选择潜在的疫苗靶点，开发有效的衣原体疫苗，需要注意以下几点：第一，选择合适的疫苗类型，以确保疫苗在提供最佳保护的同时不含潜在的致病成分，比如流产衣原体1B菌株活疫苗可能存在导致羊胚胎流产的成分[9]。第二，疫苗应该具有有效的抗原表位和较强的免疫原性，以确保诱导一个良好的细胞因子和共刺激环境，促使疫苗诱导CD4+T细胞驱动足够的Th1型细胞免疫应答和辅助性抗体反应。第三，有效的佐剂和适当的递送系统促使抗原靶向结合相应的免疫位点，增强效应器的功能，诱导充分而持久的免疫保护，预防或解决感染导致的严重并发症[10]。目前使用的衣原体疫苗递送系统分很多种：①MF59佐剂，MF59已经在抗流感疫苗方面显示出良好的耐受性，可用于不同菌株或同一菌株不同血清型的衣原体疫苗的开发[11-12]；②CpG佐剂，可提高疫苗的免疫原性，促进快速T细胞免疫应答和抗体免疫应答，但存在安全问题[13]；③病毒样颗粒(virus-like particles, VLP)媒介佐剂系统，VLP通过树突状细胞(dendritic cells, DC)上的模式识别受体进行有效的先天免疫刺激，增强细胞免疫和体液免疫反应[14-15]；④病毒载体，通常为复制缺陷型病毒，如腺病毒载体、痘苗病毒载体、流感病毒载体等，不仅引起强烈的细胞免疫应答，而且能诱导抗原高水平表达。第四，诱导有效的粘膜免疫应答是衣原体疫苗免疫策略的重点。现有研究表明，鼻腔或舌下接种Ct粘膜疫苗，在生殖道诱导强大的黏膜免疫应答[16]。第五，选择合适的感染模型检测疫苗的免疫效果。虽然小鼠、猪的感染模型能够模拟衣原体的自然感染，且成本低、易繁殖饲养，但其与人类基因存在重要差异，适合基础研究[17-18]。人类非灵长类(Non-human primates, NHP)的免疫系统与人类高度相似，但其研究费用昂贵，目前仅用于6个Ct疫苗的研究[18-19]。

2 衣原体疫苗的研究现状

2.1全菌疫苗 全菌疫苗分为减毒活疫苗和灭活疫苗。活疫苗因为能模拟自然感染、具有固有的佐剂特性，可通过口服或鼻腔注射，以及可诱导细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫反应，而具有吸引力[20]。1978年，出现第一批Ct活疫苗[21]，随后，Kari L等将Ct减毒质粒缺失株多次感染猕猴眼部，诱导了相应的免疫反应，显著降低感染率和再感染率，而且没有产生炎症性眼部病理反应[22]，类似的研究表明，与野生型鼠衣原体(Chlamydiamuridarum，Cm)相比，小鼠接种Cm质粒缺失株，输卵管积水发生率显著降低[23]。有文献报道，鼠衣原体减毒突变株(GIAM-1)感染小鼠胃肠道后可产生较强的体液免疫，预防生殖道感染[24]。灭活疫苗的出现解决了减毒活疫苗有效期短、不易保存、难以运输等问题，但不能诱导其产生细胞免疫应答和粘膜免疫应答。虽然免疫接种之前，通过减毒或灭活的方式削弱活菌的致病性，但是减毒株有可能出现毒力返祖，而且使用重组菌株接种可能会导致菌株释放到大自然中，引起生物安全隐患[20]。因此，疫苗的有效性和安全性等问题限制了衣原体全菌疫苗的发展。

2.2亚单位疫苗及重组亚单位疫苗 亚单位疫苗不含衣原体核酸，仅含衣原体部分蛋白或其表面抗原，接种后能诱发机体产生有效免疫应答。相对于全菌疫苗，亚单位疫苗安全性高，稳定性好。具有较强免疫原性的衣原体抗原，如主要外膜蛋白(major outer membrane protein, MOMP)、衣原体蛋白酶样因子(chlamydial protease-like activity factor, CPAF)和热休克蛋白60(heat shock protein 60, HSP60)已经广泛用于衣原体亚单位疫苗的研究[25]。

MOMP是衣原体包膜含量最丰富的成分，具有广泛的种属特异性，包含多个T细胞和B细胞表位，是目前衣原体疫苗研究较多的候选抗原。MOMP不仅促进衣原体黏附宿主细胞，而且作为孔蛋白，促进小分子物质通过外膜，调节衣原体的发育周期，推测其可能与衣原体原体(elementary body, EB)和网状体(reticulate body, RB)两种形式的转换有关。MOMP免疫小鼠后，可有效预防生殖系统和呼吸系统衣原体感染，预防输卵管性不孕等长期后遗症[26-27]。重组主要外膜蛋白(recombinant major outer membrane protein, rMOMP)免疫考拉或小鼠亦可诱导高水平的特异性中和抗体，增强粘膜和全身体液免疫反应[28-29]。Tifrea DF等用rMOMP首次实现预防不同血清型Ct感染，及其引起的阴道脱落、上生殖器病变和不孕。他们推测来自不同血清型的rMOMP配制的多价疫苗会引起广泛的交叉免疫保护[30]。此外，MOMP或rMOMP与磷酸盐佐剂、纳米佐剂以及阳离子脂质体佐剂(cationic adjuvant formulation，CAF)01和CAF09等联合免疫，可提高抗原特异性免疫，增强小鼠呼吸系统的保护作用[4,31-32]。

CPAF是一种衣原体丝氨酸蛋白酶，能抑制宿主细胞的信号通路，抑制感染细胞凋亡，依赖抗原特异性CD4+T细胞介导免疫应答，对清除衣原体感染很重要[33]。重组衣原体蛋白酶样因子(recombinant chlamydial protease-like activity factor, rCPAF)与IL-12或CpG佐剂联合免疫小鼠或豚鼠后，可观察到衣原体脱落显著减少，且有效预防Cm感染导致的输卵管积水、输卵管扩张和动脉粥样硬化等免疫病理改变[34-35]。此外，有文献报道称，CPAF介导的中性粒细胞失活是无症状Ct感染的关键，因为CPAF是逃避宿主天然免疫防御第一道防线的中心效应因子。因此，深入了解CPAF介导的免疫机制，可能为衣原体疫苗的开发提供新思路。

HSP60既能维持蛋白质稳态，也可触发和增强局部炎症反应，增大女性输卵管性不孕等风险[36]。实验证明，小鼠免疫接种衣原体HSP60也可诱导保护性免疫反应[37]。目前的衣原体疫苗研究中，还有许多其他的可用于设计衣原体疫苗的抗原，如巨噬细胞感染增强蛋白(MIP蛋白)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、多形态膜蛋白(polymorphic membrane protein, Pmp)等。

传统亚单位疫苗有效的避免了全菌疫苗的生物安全风险，但面临抗原提取成本高、纯化难、复性难的挑战，重组亚单位疫苗的出现解决了抗原大规模生产的问题。将免疫原性较强的抗原或重组抗原接种到宿主时，极大地削弱了抗原的免疫原性，以致于不能诱导机体产生足够的免疫反应，需通过适当的佐剂或免疫增强剂，提高免疫应答。而且，单组份、单表位亚单位疫苗不一定能提供最佳的免疫保护，小鼠衣原体感染模型研究显示多抗原、多表位疫苗可显著增强对跨血清型生殖道衣原体感染的交叉免疫保护作用[38-40]。因此，未来的衣原体亚单位疫苗研究应该进一步探索最佳抗原，深入研究衣原体蛋白表位的差异性，拓展多抗原或多表位联合免疫的策略。

2.3核酸疫苗 核酸疫苗以DNA疫苗为主，通过在质粒中构建外源目的基因片段，将其导入宿主细胞，表达相应的目的蛋白，以诱发机体产生特异性免疫应答。DNA疫苗避免了活疫苗毒力返祖的隐患，可辅助T细胞极化，特别是Th1型免疫细胞，延长疫苗的稳定性、储存和运输能力，降低生产成本[41]。研究表明，编码MOMP的DNA质粒疫苗可有效预防衣原体感染火鸡、母鼠、猪等[42-44]，同样，噬菌体介导的MOMP DNA疫苗可诱导猪产生特异性细胞免疫应答和体液免疫应答，预防流产衣原体感染[41]。小鼠接种由pcDNA质粒携带MOMP多表位和人乳头瘤病毒16型L2基因组成的DNA疫苗可以调节抗体产生，通过细胞毒性T细胞的杀伤功能来抵抗衣原体感染，减少生殖道病理损伤[45]。总之，DNA疫苗不仅同时诱导细胞免疫应答和体液免疫应答，而且一种载体可以表达多种目的蛋白，这些优势促使其成为目前疫苗研究的热点，但是还有几个问题尚待解决：①DNA可能整合到宿主染色体中；②DNA疫苗接种可能产生DNA抗体，发生自身免疫病；③人类接种DNA疫苗表达效率较低；④肌肉免疫接种DNA疫苗可能影响二次免疫效果[46]。

2.4DC疫苗 细胞疫苗作为一种过继免疫疗法，应用于治疗性和预防性疫苗的研发，比如化疗和基于抗原的疫苗[47-48]。有效的衣原体疫苗应该能够诱导产生高水平的粘膜免疫反应、系统性Th1型免疫反应以及再次感染后增强的Th1型免疫反应。虽然过继疗法可能不适合衣原体等易广泛传播的病原体的研究，但DC是人体内功能最强大的抗原呈递细胞(antigen-presenting cell, APC)，可产生IL-12，优先激活Th1型细胞反应，具有强大的共刺激能力，诱导激活多种免疫应答，有助于抗衣原体反应[49-50]。早在1998年，Su H等通过在小鼠模型中静脉注射小鼠骨髓来源的体外脉冲DC，发现其能有效吞噬衣原体，分泌IL-12 p40，呈递抗原，诱导小鼠产生倾向于Th1型特异性免疫反应，而且未引起明显的病理反应[51]。同样，感染Ct和Cm的小鼠的(骨髓源性)DC呈递衣原体特异性CD4T细胞识别的衣原体蛋白表位，加速鼻腔和生殖道病原体的清除率[50,52]。然而，由于DC迅速降解内化的蛋白，以及DC表面的MHC-I类表位在外部负载基序适配肽后，具有暂时性，使得DC疫苗的应用受到限制[53]。因此，DC疫苗还需进一步探索防止抗原降解、延长抗原释放、更有效提呈抗原的方法。

2.5菌影疫苗 菌影(bacterial ghost, BG)是无生命的细菌包膜复合物，具有良好的安全性，可携带多种蛋白质或DNA编码的抗原，可通过肠外、口服、鼻内、阴道等多种途径给药，并可通过细菌发酵生产，具有固有的佐剂特性，其颗粒特性通过识别Toll样受体或调理抗体促进DC等免疫细胞的提呈和摄取功能。由于BG的来源以及免疫接种方式不同，BG疫苗大致可分为6类(表1)。重组BG作为一种新的传递载体，将目的基因或抗原转化到合适的细菌上，使其在细胞的特定部位高表达，通过控制细胞的裂解产生BG。近年，Zhou P等研究表明，与裸DNA疫苗相比，以BG为载体，Cps MOMP与MIP联合DNA疫苗在小鼠体内诱导产生更高水平的免疫应答，抗感染能力更强[56]。因此，菌影系统作为一种新的平台技术，可用于靶向先进药物、新型微敏反应器以及各种疫苗的研发等。

表1 菌影疫苗的分类

3 展 望

衣原体疫苗经历了全菌疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、DC疫苗、BG疫苗等多种类型的疫苗，但是目前进入临床实验期的衣原体疫苗却屈指可数。安全、稳定的亚单位疫苗与DNA疫苗、DC疫苗、BG疫苗的联合免疫策略已经成为近年研究的热点，推动衣原体疫苗的发展，但是目前衣原体疫苗研究还存在许多问题：①约85%的疫苗实验在替代宿主上进行，不同宿主的安全性和免疫效果有所不同。②虽然目前常用的动物模型，如小鼠、豚鼠、猪、考拉、人类非灵长类的免疫反应与人类非常相似，但是动物实验易存在伦理问题，如考拉的感染模型出现严重的生殖问题。③疫苗免疫接种和攻毒方式不同，免疫效果也不同。在目前的研究中，免疫接种和攻毒方式大致分为粘膜接种与攻毒、系统性接种与粘膜攻毒、粘膜接种与系统性攻毒、系统性接种与攻毒以及混合接种与粘膜攻毒5种[57]。④生殖器衣原体引起人类天然免疫防御的机制尚不清楚，因为女性生殖道缺乏高度组织化的淋巴组织[24]。总之，开发人类可用的有效衣原体疫苗对于人类健康，特别是高危人群，以及人类公共卫生事业的发展具有重要意义。随着基因组学、蛋白质组学等相关新型技术的出现，大量潜在抗原和佐剂的进一步评估，DNA疫苗、DC疫苗和BG疫苗等新型疫苗的深入研究，以及多种疫苗的联合应用，或许使最佳衣原体疫苗成为可能。

利益冲突：无