YAP蛋白在结直肠癌组织中的表达情况及临床意义的研究

李西梅，罗 明，呼圣娟，王鹏达，张 淼，于晓兵，刘建芳，白飞虎

近年来，结直肠癌患者发病率逐年升高，结直肠癌的早诊早治是当前研究的热点与难点。结直肠癌患者预后评估的手段较为有限。国内外文献[1-2]均表明，YAP(Yes-associated protein)蛋白，又称Yes激酶相关蛋白，参与结直肠癌细胞的生长，调节肿瘤细胞迁移和入侵，在肿瘤的侵袭、转移等过程中有重要的意义。YAP蛋白有望成为结直肠癌早诊早治的生物标记物。本研究通过检测YAP蛋白在结直肠癌组织中的表达情况，明确YAP蛋白的表达与结直肠癌临床病理特征的关系。探讨YAP蛋白的阳性表达对于结直肠癌患者的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料:收集2015年1月-2017年1月期间在我院确诊为结直肠癌的患者80例(结直肠癌组)并收集癌块组织，同时收集癌旁组织的石蜡块80例(癌旁组)；采用结肠镜检查正常的体检人群的结直肠黏膜石蜡块80例(健康人群组)。确保入组结直肠癌组织在石蜡包埋前均未进行化疗与放疗，所有病例均为结直肠癌原发肿瘤，且已排除患严重的内分泌系统疾患。所有入组对象均由本人或委托人签署伦理委员会通过的知情同意书。入组的结直肠癌组与癌旁组中，男性42例，女性38例，平均年龄(52±4.5)岁。选择健康体检者80例作为对照组，其中男性40例，女性40例，平均年龄(50±6.1)岁。3组资料进行方差齐性检验，资料具有可比性(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 调取病例资料：电话随访核对入组者基本信息，包括性别、年龄。结直肠癌组病例登记肿瘤直径、病理分化程度、TNM分期，记录3年生存时间。

1.2.2 免疫组化法检测:YAP蛋白的表达。对收集的石蜡块进行切片，之后行HE染色再次确认诊断。本研究中主要试剂YAP兔抗人多克隆抗体购自博奥森公司。将石蜡切片进行脱蜡、水化，按照免疫组化抗体说明书操作，3%过氧化氢30 min 阻断内源性过氧化物酶，使用pH6.0的0.01M柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复。正常山羊血清作为一抗，37 ℃孵育20 min。稀释抗YAP多克隆抗体至工作浓度1∶150,抗YAP多克隆抗体4 ℃过夜，之后进行DAB染色、复染、脱水、透明，最后封片后显微镜下判读。所有切片结果均由两名病理科副主任医师经培训后判读。判读的参考标准[3]综合考虑了染色程度和染色细胞百分比。依照染色程度，未染色判断为0分，淡黄色判断为1分，棕黄色判断为2分，棕褐色判断为3分。依照染色细胞百分比，每例切片随机选5个高倍视野,将阳性细胞数与同类细胞数进行百分比，选取百分比的平均值，如平均百分比<5%则判断为0；5%～25%判断为1；25%～50%判定为2；平均百分比>50%判定为3。将染色程度与染色细胞平均百分比所得分数相乘，得分≥2为阳性，<2为阴性。

2 结果

2.1 YAP蛋白在组织中的表达情况:YAP蛋白在结直肠癌组织胞浆和胞核中均呈阳性表达，显微镜下为棕黄色，见图1(目录后)。其在癌旁组织和正常肠黏膜组织中多为阴性表达，见图2、图3(目录后)。YAP蛋白在结直肠癌组、癌旁组织组以及健康人群组中的阳性表达率见表1。结直肠癌组、癌旁组以及健康人群组的阳性表达率进行χ2检验，χ2值为39.341,差异有统计学意义(P<0.05)，提示3组之间的YAP阳性表达率不同。分别进行组间比较，结直肠癌组与癌旁组，结直肠癌组与健康人群组的YAP阳性表达率均不同，其χ2值分别为25.664、30.861(P<0.05)，而癌旁组与正常肠黏膜组比较，χ2值为0.295(P>0.05)。

表1 结直肠癌、癌旁、健康人群中YAP蛋白表达情况的比较[n(%)]

2.2 YAP蛋白在结直肠癌组织中的表达情况与临床病理特征的关系:不同性别、年龄、肿瘤直径组的结直肠癌组织中YAP蛋白的表达率差异无统计学意义(P>0.05)。不同TNM分期、病理分化程度组的结直肠癌组织中YAP蛋白阳性表达率不同(P<0.05)，见表2。

表2 不同临床病理特征分组中结直肠癌组织的YAP蛋白表达情况的比较[n(%)]

2.3 YAP蛋白的表达情况与结直肠癌患者预后的相关性:电话随访中，结直肠癌组有21例死亡，其中YAP阳性者19例，YAP阴性者3例。统计分析入组结直肠癌患者平均生存期为29.638月，标准误为1.228，95%的可信区间为27.231～32.044。Kaplan-Meier法又称乘积极限法，该法可绘制YAP阴性组与阳性组的结直肠癌患者的生存函数曲线(见图4，目录后)，图中显示随着时间的增加，生存率是下降的。Kaplan-Meier法进行时序检验，统计量为4.209，P值为0.04(P<0.05)，说明两条曲线的生存率不同。从YAP阴性组与阳性组结直肠癌患者的生存分析函数曲线图可看出，YAP阴性组曲线始终在YAP阳性组的曲线之上，说明YAP阴性组患者三年生存率高于YAP阳性组。

3 讨论

YAP蛋白(Yes-associated protein)[4]最初在1994年被鉴定为非受体酪氨酸激酶YES1的结合蛋白。YAP蛋白是一种转录辅助激活因子，是Hippo途径的下游效应分子。Hippo/YAP信号通路[5]是维持细胞极性的重要途径，是组织稳态、器官大小和干细胞的重要调节因子。YAP蛋白在小细胞肺癌、胃癌、食管鳞癌等各种肿瘤中异常表达，包括结肠直肠癌。近年来，研究者发现[6]YAP靶基因的表达升高是5-FU耐药细胞的主要变化，故提出YAP信号在结直肠癌耐药过程中也有重要意义。

YAP蛋白[7]在结直肠癌进展的不同状态中具有致癌和抑癌的双重作用机制。部分研究[2]支持YAP的高表达与肿瘤进展和降低生存率有关。因此，YAP有可能成为结直肠癌的肿瘤生物标志物或治疗靶点。然而，部分研究[8]显示，YAP作为肿瘤抑制因子的矛盾作用，显示其抑制结直肠癌的发生，参与促进细胞凋亡，抑制肠干细胞的维持和炎症活性。本研究显示，YAP蛋白在结直肠癌组织中呈高表达。其表达阳性率与肿瘤分期、分化程度有关。陈海滨等人[9]研究发现，YAP蛋白的表达与结直肠癌组织的大小、分化程度、淋巴转移 Dukes 分期有关，两者表达呈正相关。但在本研究中YAP蛋白的表达与肿瘤组织的直径并无明显关系，故仍需大样本的研究进一步证实。

文献资料表明[10]YAP蛋白在老年胃癌组织中的表达异常升高,且与胃癌患者预后不良相关。本研究经采用Kaplan-Meier法比较YAP蛋白阳性表达与阴性表达的结直肠癌患者的生存率具有统计学差异，YAP阴性组结直肠癌患者三年生存率高于YAP阳性组。YAP蛋白的表达情况对于结直肠癌患者的预后评估有一定参考意义，在一定程度上能够指导临床上制定个体化诊疗方案。YAP蛋白在结直肠癌中的作用机制较为复杂。高振文等[1]应用免疫组织化学法检测结直肠癌原发灶及其多器官转移灶中YAP及N-钙黏蛋白的表达,应用qRT-PCR和Western blotting检测YAP、N-钙黏蛋白及E-钙黏蛋白在6种结直肠癌细胞中的表达，进而推测YAP蛋白能够通过调控上皮-间质转化过程,促进结直肠癌的发展及转移。因YAP蛋白在结直肠癌细胞核中常呈过表达，故有研究[5]推测YAP介导的结肠癌调控的分子机制与YAP蛋白磷酸化和亚细胞定位有关。近期研究发现[11]Glut3-YAP信号通路的激活可以作为主激活因子来重新编程癌症的代谢，从而促进转移，提出YAP蛋白可参与肿瘤代谢的重编程。目前对于YAP蛋白在结直肠癌发生、侵袭、转移等的具体作用机制仍需进一步研究。