β-谷甾醇及其衍生物的溶解性特征及抗抑郁活性研究

曹馨元，刘晓峰，尹永霞，王 波，黄文华

β-谷甾醇(Sit)属于植物甾醇，植物甾醇主要包括β-谷甾醇、豆固醇、菜油甾醇，是稳定植物细胞膜磷脂双层的必需类固醇分子，具有多种生物活性[1-2]。植物甾醇在体内具有多种健康益处，尤其是针对各种慢性疾病的保护，例如心血管疾病、糖尿病、癌症和肝损伤。植物甾醇由于其众所周知的降低胆固醇的特性而引起了人们的极大兴趣[3-4]，但是纯植物甾醇不溶于水，也几乎不溶于油脂，甚至在较高浓度的液体介质中容易形成晶体，在很大程度上限制了其进一步开发和利用。本项目组通过酯化修饰[5]了Sit的化学结构，开展了Sit及其衍生物的溶解性质和脂水分配系数测定实验研究，并且通过小鼠悬尾应激和强迫游泳实验[6-8]，初步评价Sit及其衍生物的抗抑郁活性，为其抗抑郁作用药效物质基础研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料:Sit及其衍生物(实验室自制，纯度大于 98%)；瑞波西汀(规格：50 mg/瓶，上海源叶生物科技有限公司，LOT：P03M6D12653)；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。高效液相色谱仪(北京创新通恒科技有限公司，CXTH-3000)；离心机(美国BECMAN公司，Avanti TM J-301)；氮吹仪(极恒实业有限公司，JHD-001)；漩涡混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司，XW-80A)；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，KQ-250B)；恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司，DHG-9140A)。

1.2 实验动物:成年雄性ICR小鼠112只(体重18～20 g)，饲养条件(温度 23±2 ℃，相对湿度 50%±10%，12 h光照/暗循环，早上7:00开灯)，自由摄食及水。适应1周后，随机分为空白对照组(10%丙二醇溶液)，阳性对照组瑞波西汀(Reboxetine)、β-谷甾醇(Sit)、山梨酸 Sit 酯(Sit-Sr)、苯丙氨酸-Sit 酯(Sit-P)、2-四氢糠酸-Sit 酯(Sit-T)、水杨酸-Sit 酯(Sit-S)，每组8只，2.5mg/kg。各组小鼠均腹腔注射给药，给药体积均为1.0 mL。给药1 h后，各取1批小鼠分别进行悬尾实验和强迫游泳实验。

1.3 方法

1.3.1 Sit及其衍生物的溶解度测定[9]:将Sit及其衍生物分别加入到一定体积的水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿和石油醚中。振荡混合5 min后超声10 min，静置，30 min内无可见的溶质颗粒，则认为完全溶解。

1.3.2 Sit及其衍生物的脂水分配系数测定

1.3.2.1 溶剂预饱和及样品的制备[10]:将正辛醇与蒸馏水置于恒温摇床振荡24 h使其饱和，静置，待两相分离完全后，将蒸馏水饱和的正辛醇配制成浓度为1.0 mg/mL、0.01 mg/mL的Sit及其衍生物溶液。

1.3.2.2 色谱条件:反相C18 色谱柱(100 × 2.1 mm，3.5 μm)，柱温40 ℃；流动相：甲醇-乙腈(30∶70，v/v)，流速0.5 mL/min，检测波长210 nm，进样量5 μL。

1.3.2.3 Sit及其衍生物标准曲线的制备:用甲醇分别配制0.5 mg/mL的Sit及其衍生物的标准母液，并稀释得浓度为5 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的标准溶液。并以对照品浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，得线性回归方程。

1.3.2.4 精密度实验:按照上述色谱条件，分别吸取100 μg/mL的Sit及其衍生物标准溶液，分别连续进样6次，测定并计算获得RSD。

1.3.2.5 稳定性实验:按照上述色谱条件，于0、2、4、6、8 h分别测定1.0 mg/mL的Sit及其衍生物的正辛醇(二次蒸馏水饱和的)溶液，0.01 mg/mL的Sit及其衍生物的二次蒸馏水(正辛醇饱和的)溶液的峰面积，并计算获得其RSD。

1.3.2.6 脂水分配系数的测定及计算:10 mL的1.0 mg/mL的Sit及其衍生物的正辛醇溶液与10 mL二次蒸馏水溶液混合，25 ℃振摇48 h，分离有机相和水相，检测两项中的Sit及其衍生物的浓度，每个样品平行测定3次。按下式计算正辛醇/水分配系数，lg P = lg(Co/Cw)，式中Co为正辛醇相中的浓度，Cw为水相中的浓度。Sit及其衍生物在正辛醇/水中的脂水分配系数测试结果见表4。

1.3.3 β-谷甾醇及其衍生物抗抑郁活性筛选研究[11]

1.3.3.1 小鼠悬尾应激实验(TST):实验小鼠腹腔注射给药1 h后，尾巴悬挂固定于离地约45 cm杆上，使其头部朝下并呈倒悬状，观察并记录小鼠四肢静止不动时的时间。

1.3.3.2 小鼠强迫游泳实验(FST):将实验小鼠放置于一透明水桶内，水温控制在25±2℃。待小鼠入水后开始计时，总共6 min，记录后4 min内小鼠的持续不动时间(s)。

2 结果

2.1 Sit及其衍生物的溶解度测定结果:由表1中的实验结果可知，对Sit进行酯化衍生化处理可以增加其脂溶性。在石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯有机溶剂中，Sit-Sr的溶解度大于Sit-S、Sit-P和Sit-T；而在甲醇和乙醇中，Sit-S的溶解度大于Sit-Sr、Sit-P和Sit-T。

表1 Sit及其衍生物的溶解度

2.2 Sit及其衍生物的脂水分配系数测定结果

2.2.1 线性关系考察:表2的线性考察结果显示，Sit在0.00512～0.512 mg/mL、Sit-Sr在0.00508～0.508 mg/mL、Sit-P在0.00524～0.524 mg/mL、Sit-T在0.00511～0.511 mg/mL、Sit-S在0.00531～0.531 mg/mL范围内具有较好的线性关系。

表2 标准曲线测定结果

2.2.2 精密度及稳定性考察:由表3结果显示，RSD均小于2%，表明仪器精密度良好，且正辛醇和二次蒸馏水中的各化合物在8h内稳定。

表3 精密度及稳定性结果(RSD)

2.2.3 脂水分配系数的测定及计算结果:由表4可知，在Sit的衍生物中，因甾体母核的C-3位发生了酯化反应，并接入羧酸类物质形成了酯键，所以整体Sit的酯化衍生物中除Sit-P外的lg P值均大于Sit 的lg P值，其中Sit-Sr与Sit-S的lg P相近，大于Sit-T、Sit、Sit-P。这进一步说明，随着因酯化反应脂肪连或环的引入，使得Sit衍生物的脂溶性进一步增大。

表4 Sit及其衍生物的脂水分配系数测定结果(n=3)

2.2.4 脂水分配系数的测定及计算结果:由表5可知，TST指标经单因素方差分析，7组差异有统计学意义(F=106.435)，进而采用LSD法两两比较发现，Reboxetine、Sit、Sit-T、 Sit-P、Sit-Sr、Sit-S组与空白对照组的差异均有统计学意义(P<0.05)，Sit、Sit-T、 Sit-P、 Sit-S组与Reboxetine对照组的差异均有统计学意义(对应的t值分别为7.569、7.874、2.809、4.423)。FST指标经单因素方差分析，7组差异有统计学意义(F=33.476)，进而采用LSD法两两比较发现，Reboxetine、Sit、Sit-T、 Sit-P、Sit-Sr、Sit-S组与空白对照组的差异均有统计学意义(P<0.05)，Sit、Sit-T、 Sit-P、Sit-Sr、Sit-S组与Reboxetine对照组的差异均有统计学意义(P<0.05)。可认为在剂量为2.5 mg/kg时，与Sit、Sit-T、 Sit-P、Sit-Sr给药组相比，Sit-S给药组小鼠在悬尾应激实验及强迫游泳实验中的不动时间最短，表现出较显著的抗抑郁活性。

表5 Sit及其衍生物在TST和FST中的抗抑郁作用

3 讨论

β-谷甾醇作为植物甾醇的一种，在降低血清胆固醇水平、抗高血脂症、预防心血管疾病、抗癌、抗炎和免疫调节等方面有较好的生物活性，但溶解特性极大限制了其应用和发展。项目组前期通过酯化修饰了Sit的化学结构，得到了Sit-T、Sit-P、Sit-Sr、Sit-S四种酯化衍生物。通过溶解性质和脂水分配系数测定实验，得出Sit-S和Sit-Sr的溶解性和lg P值均强于Sit及其他衍生物。通过小鼠悬尾和强迫游泳实验对Sit及其衍生物的抗抑郁作用进行了初步评价，得出Sit-S可显著缩短小鼠悬尾的不动时间和强迫游泳不动时间，进一步说明酯化修饰可使脂溶性增强，从而更易通过血脑屏障发挥抗抑郁活性。为了验证Sit的酯化衍生物是否可以通过提高其脂溶性，改变其药代动力学特征及分布和排泄特性，还需要进一步进行实验分析。