基于壳聚糖/β-甘油磷酸钠(CS/β-GP)温敏型水凝胶的细胞表面壳化及对癌细胞行为的影响研究*

许 浩,魏 延,2,徐双梦,苏 慧,李涵琴,黄 棣,2,王楷群,2,胡银春,2

(1. 太原理工大学 生物医学工程学院生物医学工程系，纳米生物材料与再生医学研究中心，太原 030024；2. 太原理工大学 生物医学工程研究所，材料强度与结构冲击山西省重点实验室，太原 030024)

0 引 言

手术切除、放疗和化疗依然是目前癌症治疗的三大主要方法[1-3]。手术对于良性肿瘤和非转移瘤的治疗效果显著，但手术的创伤大，严重影响患者的正常起居，且手术切除的不彻底性会导致较高的复发率；放疗和化疗在一些癌症治疗方面已经取得了良好的效果，但其毒副作用及耐药性也导致其应用受限。随着现代医学科学的不断发展以及对肿瘤研究的日渐深入，靶向治疗、免疫治疗等新兴疗法大大提高了治疗的精准性，且毒副作用小，但治疗费用昂贵，且目前临床上免疫治疗尚未存在治疗标准，所以寻找平价安全的癌症治疗方法仍然迫在眉睫。

癌症难以治愈的根本原因在于其早期的难以诊断以及高转移性，因此抑制癌细胞的增殖、运动迁移等行为是一种较为直接高效的策略。目前抑制癌细胞迁移的方式多采用小分子干扰或抑制细胞的运动信号通道等方式，但是该类方式依然无法避免耐药性的产生。我们提出一种假设，通过在癌细胞表面包裹生物相容性良好的高分子或无机物，以物理约束的方式限制甚至抑制癌细胞的增殖及运动行为，进而达到治疗癌症的目的。

目前包裹癌细胞的方式有很多，其中较为简单快捷地方式是层层自组装[4]，即利用癌细胞表面微弱的负电荷在癌细胞表面反复交替沉积正、负聚电解质，进而在癌细胞表面包裹一层或多层聚电解质。目前常用包裹的聚电解质主要有聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDDA)、聚苯乙烯磺酸钠(PSS)[5]、明胶[6]、壳聚糖[7]、聚赖氨酸[8]、鞣酸(TA)、聚吡咯烷酮(PVPON)[9]等，但聚电解质包裹只表现弱毒或无毒特性[10]，不具有杀伤肿瘤细胞的能力。而肿瘤疗法中应用较广的磁热治疗也只能利用肿瘤细胞的非耐热性在药物附近发挥疗效，无法有效阻止癌细胞的逃逸。因此，利用具有一定的温度敏感性的水凝胶限制癌细胞的迁徙及增殖有利于提高磁热疗的效能。

Chenite等人于2000年首次报道了一种基于壳聚糖-甘油磷酸钠复合物(CS/GP)的水凝胶，此复合物具有温敏性特点，即在室温下保持液态，当温度升高到37 ℃ 后发生凝胶化，且注入人体后可降解为无毒的氨基葡萄糖被人体完全吸收[11]。后人通过优化CS/GP配比，将其应用于关节软骨细胞[12]、胎鼠的大脑皮质细胞[13]的培养以及兔颈动脉和肾动脉栓塞[14-16]等。

本文是在此研究的基础上，制备了温敏型 CS/β-GP 水凝胶，并用水凝胶包裹癌细胞，利用水凝胶的温敏特性研究其对癌细胞的迁移性能以及生理活性的影响，以求为改善磁热治疗效能提供可能。

1 实 验

1.1 材料

脱乙酰度95%壳聚糖(CS，Aladdin)、冰乙酸(天津市凯通化学试剂有限公司)、β-甘油磷酸钠(β-GP，SIGMA)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、新生牛血清(四季青)，青霉素-链霉素溶液(HyClone)，RPMI 1640(Gibco)培养基。LIVE/DEAD© Viability/Cytotoxicity Kit 购自于美国Thermo Fisher 公司。

人卵巢癌细胞系(SK-OV-3)和人宫颈癌细胞系(HeLa)购自中国科学院细胞库，小鼠成纤维细胞(L929)来自太原理工大学生物医学工程研究所。将细胞种植于含有10%新生牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的RPMI 1640培养基中，并置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

1.2 方法

1.2.1 温敏型CS/β-GP水凝胶的制备

将200 mg CS溶于9 mL冰乙酸(0.1M)中配成2%(w/v)的CS溶液，缓慢滴加，磁力搅拌1～2 h。溶解完全后高温高压灭菌30 min。

将560 mg β-GP溶于1 mL RPMI 1640培养基中，配成56%(w/v)的β-GP溶液，用0.22 μm滤器过滤除菌，4 ℃冰箱保存。冰浴15 min后，按体积比1∶3将56%β-GP溶液逐滴添加到2%CS溶液中，边滴加边轻轻摇晃，得到CS/β-GP水凝胶[17]。

图1 癌细胞表面包裹水凝胶示意图Fig 1 Schematic of the cancer cells encapsulated with hydrogel

1.2.2 SEM形貌及FT-IR图谱

分别取2mL 2% 的 CS 溶液、56% 的 β-GP 溶液、室温下未交联的 CS/β-GP 混合溶液以及37 ℃ 交联的CS/β-GP 凝胶于6孔板中，液氮骤冷后，冷冻干燥24h 取出。取适量样品，使用场发射扫描电镜(SEM，JSM-7100F，日本)和傅里叶变换红外光谱仪(FTIR，Bruke alpha，德国)对上述材料的形貌和结构进行表征。

1.2.3 细胞划痕

将细胞接种至12孔板，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h 后，吸去培养基，用20 μL枪头在孔道中央划一条直线，然后用RPMI 1640培养基清洗2～3遍，最后给孔板加入水凝胶(每孔200 μL)。分别于相应温度培养箱中培养0 h、8 h、24 h 后用荧光倒置显微镜(ECLIPSE Ti，Nikon，Japan)观察划痕边缘细胞的生长迁移情况。

1.2.4 荧光检测

为进一步评估温敏性水凝胶对肿瘤细胞迁移性能的影响，设计用荧光染色(Calcein AM/EthD-1)检测细胞包裹水凝胶后细胞的生理活性。根据细胞试剂盒的使用方法：将2.5 μL Calcein-AM和10 μL EthD-1加入5 mL PBS中来制备活/死储备溶液。将细胞接种至玻片上，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h 后，用RPMI 1640培养基清洗2～3遍，然后向载细胞玻片加入水凝胶(每片200 μL)并置于相应温度培养箱中培养24 h。在室温、黑暗环境中将储备溶液滴加到涂覆水凝胶的细胞中静置40min。用PBS洗涤细胞并用荧光抗猝灭剂密封，然后用荧光倒置显微镜观察细胞状态。

2 结果

2.1 水凝胶的温敏特性

室温下我们制备的水凝胶(图2)为透明液体，在37 ℃ 培养箱内放置30 min中后即可凝固，但取出后一段时间(约20 min)便可融为液态。

图2 CS/β-GP 混合物在室温下以及37 ℃时状态Fig 2 CS/β-GP mix at room temperature and 37 ℃

2.2 SEM形貌

图3(A)为 CS 的SEM图，可见 CS 分子交错分布，但孔隙分布不均匀。图3(B)为CS/β-GP 凝胶的SEM图，可见β-GP 的加入使得CS分布均匀并形成贯通微孔结构，有利于水及大分子物质的递送。

图3 CS (A) 和 CS/β-GP (B) 的SEM图Fig 3 SEM photos of CS and CS/β-GP dry hydrogel

2.3 FT-IR 图谱

图4 CS、β-GP和CS/β-GP 的FT-IR图谱Fig 4 FT-IR spectrum of CS, β-GP and CS/β-GP dry hydrogel

2.4 划痕法检测水凝胶对细胞迁移性能的影响

从图5看出，未加水凝胶的卵巢癌细胞在8 h就出现明显的向中央划痕区域迁移生长的现象，24 h 后中间划痕区细胞数量明显增多，间距缩小；而水凝胶包覆后的细胞在培养8 h 后细胞数量虽略有增加，但未见明显的向划痕区迁移的现象，随着培养时间的延长，细胞的迁移运动基本停滞，划痕区间距基本保持不变。

图5 通过划痕测定水凝胶对癌细胞系迁移的影响。注：图中标尺为100μmFig 5 Effects of hydrogels on the migration of cancer cell lines by the scratch wound healing assay. Note: the scale bar in the figure is 100 μm

2.5 荧光染色

Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein留在细胞内,发出强绿色荧光[20]。EthD-1是一种红色荧光染料，只能进入死细胞。从图6可以看出未涂覆水凝胶的卵巢癌细胞在显微镜激发下发出强绿色荧光，说明卵巢癌细胞活性良好；而添加水凝胶之后细胞几乎都发出红色荧光，说明水凝胶抑制了卵巢癌细胞的活性，卵巢癌细胞开始凋亡。

图6 包覆水凝胶后卵巢癌细胞的活死荧光显微图像；注：图中标尺为100μmFig 6 Live and dead fluorescence microscopy images of SK-OV-3 cell covered with hydrogel after 24 h incubation. Note: the Scale bar in the figure is 100 μm

图7显示了水凝胶覆盖的人宫颈癌细胞和小鼠成纤维细胞的活死荧光显微图像，可以看出水凝胶对卵巢癌细胞的抑制效果要略强于宫颈癌细胞，对宫颈癌细胞和卵巢癌细胞的抑制效果则明显强于小鼠成纤维细胞。可以证明，该水凝胶可抑制癌细胞的生理活性，而对正常细胞影响较小。

图7 覆盖水凝胶的宫颈癌细胞和小数成纤维细胞的活死荧光显微图像 注：图中标尺为100μmFig 7 Live and dead fluorescence microscopy images of SK-OV-3 and L929 cell covered with hydrogel after 24 h incubation. Note: the Scale bar in the figure is 100 μm

3 讨 论

壳聚糖是天然生物多糖，来源广泛，成本低廉，具有良好的生物相容性和可黏附性，在含溶菌酶的动物体内能被降解为无毒的氨基葡萄糖，且在体内不积聚、无刺激、无免疫原性，可被人体完全吸收利用，是良好的组织工程材料[21-22]。研究发现壳聚糖脱乙酰度的增高有助于炎性反应的减少，且壳聚糖的降解速度也与其脱乙酰度有关，脱乙酰度越高，生物降解速度越慢[23]。本文研究的最终目的是：用壳聚糖制备的水凝胶在体温环境下可以凭借其温敏凝固特性来抑制癌细胞的迁移运动而对正常组织细胞不产生有害影响。 故本实验选择95% 高脱乙酰度的壳聚糖，旨在减少炎症反应的发生的同时，保持凝胶聚合物较慢的降解速度。

关于温敏性水凝胶CS/GP的自凝机制。研究表明是由于β-甘油磷酸钠的加入直接影响了壳聚糖链间的静电力、疏水作用以及氢键作用[4]。加入β-甘油磷酸钠后的弱碱作用使甘油磷酸钠上的磷酸盐和壳聚糖上的胺基相互吸引而使甘油部分暴露，壳聚糖链分解，故壳聚糖在较高的pH值下仍可保持液态[19]。加热后，由于疏水键和氢键的引力大于链间的静电排斥力，壳聚糖链间的部分片段发生物理结合，而表现凝胶化。本文所制备水凝胶的创新点在于用RPMI 1640培养基来溶解GP，使得加入β-甘油磷酸钠后的碱性作用增强，进而导致壳聚糖在高pH环境下保持液态时间更久，这也是经加热后相较于他人研究的温敏型CS/β-GP水凝胶凝固时间变长的原因。本文制备的温敏型CS/β-GP水凝胶凝固时间为30 min，无论是体外研究还是体内注射，都避免了水凝胶提前凝固的弊端，且RPMI 1640培养基的加入会提高水凝胶的生物相容性，有助于维持正常组织细胞的生理活性。

研究结果显示，我们制备的温敏型CS/β-GP水凝胶能选择性的抑制癌细胞的生理活性，主要原因在于壳聚糖对癌细胞具有直接的抑制作用。目前壳聚糖抑癌机理主要有以下几种原因：第一，癌细胞表面比正常细胞表面具有更多的负电荷，而壳聚糖带阳离子特征表现正电荷，直接作用于癌细胞表面，从而抑制癌细胞的生长；第二，壳聚糖通过抑制丙酮酸激酶作用来抑制糖酵解过程，减少细胞的葡萄糖摄取和 ATP水平干扰癌细胞的代谢进而发挥抑癌作用，但对正常肝细胞和肌细胞则没有影响；第三，壳聚糖进一步解聚可生成水溶性壳聚糖和低分子壳寡糖，壳寡糖可使癌细胞核碎裂、固缩、染色质聚集，对肿瘤细胞有直接的抑制作用。除了壳聚糖对细胞的分子作用外，水凝胶的包裹相当于对癌细胞表面施加应力作用，具有抑制癌细胞迁移运动的功效。

4 结 论

(1)以细胞培养基为溶液配制凝胶体系，成功制备了生物相容性良好、凝胶时间可控的温敏型CS/β-GP水凝胶，该水凝胶在37 ℃ 下30min即可凝固，且降解速度缓慢。

(2)研究发现，用CS/β-GP水凝胶包裹癌细胞和小鼠成纤维细胞，水凝胶可明显抑制癌细胞的迁移性能和生理活性，而对小鼠成纤维细胞的生理活性影响较小。

(3)用温敏性水凝胶包裹癌细胞的方法无毒高效，且无需任何昂贵的抗肿瘤药物便可达到抑制癌细胞活动的目的，为以后磁热治疗耦合壳化治疗肿瘤提供了可能，有望成为肿瘤治疗的新策略。