α-磷酸三钙/α-半水硫酸钙复合骨水泥的制备及力载荷下的性能研究*

宋亚萍，连小洁,2，高志鹏,2，侯丁煜，黄 棣,2，魏 延,2

(1. 太原理工大学 生物医学工程学院生物医学工程系，纳米生物材料与再生医学研究中心，太原 030024；2. 太原理工大学 生物医学工程研究所，材料强度与结构冲击山西省重点实验室，太原 030024)

0 引 言

在人体中，骨骼除了支撑人体外，还可以保护内部器官；贮存矿物质；在运动系统中传递力。在日常生活中，衰老、感染、肿瘤、创伤、骨髓炎手术清创以及先天性疾病都可能导致骨组织的结构完整性受到一定的破坏，临床上称为骨缺损。

目前，骨缺损有很多类型，例如骨折，临床手术中保守的治疗方法为对受损部位通过石膏、夹板、支具等进行固定，手术治疗方法为钢板固定、经皮穿针等，研究表明，保守的治疗方法无法满足患者对骨功能修复的要求，手术治疗方法会引起相应的并发症[1]。再如骨不连，人体组织自身的修复潜能无法保证受损骨可进行局部骨诱导生成新骨，且会在一定程度上引起炎症流脓，从而产生积液，临床上需要进行骨移植治疗[2]。最大程度减轻病人的痛苦，减少手术创伤，减少手术并发症的几率至关重要[3]。

对骨折引起的骨移位及骨裂缝，难以自我愈合的骨不连，制备一种骨黏合剂来辅助治疗效果更佳，既可固定骨折，也可以减少甚至避免钢板等金属材料的植入[4]，暂时填补骨缺损带来的组织空缺，减少机体由于处于不稳定环境下而采取的一系列过激的保护措施，减少引发炎症的概率，除此之外，还可以通过载药诱导受损骨两端骨细胞长入骨黏合剂，并分泌有关物质使其降解，从而完成骨重建。因此找到一种较为安全的骨黏结剂，使用注射器将其注射到缺损部位，实现微创修复就成了骨缺损患者的福音[5]。

本文研究旨在找到一种可降解性骨修复材料，在不影响骨的正常形态的情况下，填补骨缺损，一来减少炎症的发生，二来作为缺损部位骨细胞长入的支架，在骨重建的过程中逐渐降解。

人体骨在纳米结构上由无机物质羟基磷灰石(hydroxyapatite, HA)晶体与有机蛋白(糖蛋白、胶原蛋白、蛋白多糖)按一定的比例组合而成，HA的含量决定了骨的力学强度[6]。为使新骨与原本骨结构相似，骨黏合剂应为与HA结构相似的物质从而更好的模拟人体骨结构。HA晶型属于六方晶系，在晶粒生长过程中沿a、c轴的方向生长或随机生长其晶体形态不同，目前研究发现，其沿c轴生长的晶体形貌为板片状，各性能也与人体内HA更为相似[7-9]。

研究表明，磷酸钙骨水泥(calcium phosphatecement,CPC)水化产物可逐步转化为HA[10]，具有良好的生物相容性、生物安全性、自固化性、可塑性、可降解性、可载药性[11-12]，因此磷酸钙骨水泥更适合作为骨黏合剂来修复骨缺损。磷酸钙骨水泥是由α-TCP、β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)、磷酸氢钙(dicalcium phosphatedehydrate,DCPD)、无水磷酸氢钙(dicalcium phosphate anhydrate,DCPA)、磷酸四钙(tetricalcium phosphate,TTCP)等两种及两种以上磷酸钙盐,由柠檬酸、生理盐水、磷酸二氢钠等固化液混合后形成的骨黏合剂[13]。其中磷酸三钙(TCP)是一种重要的可吸收磷酸钙生物材料，是磷酸钙的中间相。TCP 由于其优异的骨传导性和生物降解性，已被用作骨替代物的理想候选物、生物可降解复合材料的无机填充物、评价细胞接种有效性、增殖、成骨分化的基质、刺激骨愈合和骨生成的骨生长因子的载体、药物载体、发光材料和催化剂[14]。

α-TCP是目前临床上理想的骨修复材料之一[15]，钙磷比接近1.5，在与水混合后可以进行钙磷原子重排获得钙磷比为1.67的羟基磷灰石，但其降解速度慢于新骨形成的速度[16]，如果应用于临床，可能会影响骨缺损的愈合。

为加快α-TCP的降解速度，本文将其与具有一定生物相容性和生物降解性，且降解速度将快的α-半水硫酸钙(α-calcium sulfate hemihydrate, α-CSH)复合，并模拟人骨受力状态，对其凝固时间、静态力学性能、动态力学性能、降解性能以及生物相容性进行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 α-TCP的制备

α-TCP以碳酸钙(CaCO3)，磷酸(H3PO4)，氢氧化钙(Ca(OH)2)为原料，按式(1)～(3)制备得到磷酸三钙(Ca3(PO4)2)后，经程序控温高温煅烧至1400℃后获得，程序控温升温步骤如图1所示。

图1 程序控温升温步骤Fig 1 Programmed temperature control step

CaCO3+2H3PO4→Ca(H2PO4)2+H2O+CO2↑

(1)

Ca(H2PO4)2+Ca(OH)2→2CaHPO4+2H2O

(2)

2CaHPO4+CaCO3→Ca3(PO4)2+H2O+CO2↑

(3)

1.1.2 α-CSH的制备

α-CSH以二水硫酸钙(calciumsulphate dehydrate, CSD)为原料，经水热合成法获得，将CSD置于立式压力蒸汽灭菌器中(LDZF-30KB-Ⅱ，上海申安医疗器械厂)，温度设为127 ℃，灭菌9 h，后置于烘箱中2 h即可获得α-CSH。

1.1.3 固化液的制备

固化液为2.5%(质量分数)的磷酸氢二钠(sodium hydrogen phosphate, Na2HPO4)溶液，有研究表明，将Na2HPO4作为固化液，在降解过程中可致孔[17]。

1.2 α-TCP/α-CSH的制备

复合材料以α-TCP为主要占质量比材料(占比分别为100%，95%，90%，85%，80%，75%)与α-CSH在搅拌器皿中混合后，按液固比(L/S)0.4 mL/g加入固化液，搅拌均匀，倒入模具，待其凝固后脱模，分别制备骨水泥柱与骨水泥粒用于力学性能与降解性能的研究，样品尺寸如图2。

图2 样品尺寸Fig 2 Size of samples

1.3 凝固时间的测定

凝固时间的测定选择φ10 mm×15 mm的圆柱形模具，混合材料总质量为3 g，加入固化液搅拌均匀后倒入模具，用搅拌勺加压去除内部气泡并保证材料两端平整，置于空气中，利用维卡仪测定其凝固时间，α-TCP占比不同的材料每组设有5个平行试样。

1.4 静态力学性能的测定

将制备的φ10 mm×15 mm的骨水泥柱置于空气中一周后，用砂纸将柱状材料两底面打磨光滑平整，利用万能材料试验机(INSTRON5544，英斯特朗公司)对其加载，采用位移控制的方式，设定其加载速度为1 mm/min，记录其最大抗压力，α-TCP占比不同的材料每组设有4个平行试样。

1.5 动态力学性能的测定

将制备的φ10 mm×15 mm的骨水泥柱，置于空气中一周后，用砂纸将材料打磨光滑平整，利用万能材料试验机对其进行动态循环加载，加载方式模拟人行走时膝盖受力的波形图，加载方式通过软件Bluehill Universal设定，由于α-TCP占比不同会影响其抗压强度，所以设置动态循环加载峰值时需参考静态力学性能测试中的结果，α-TCP占比不同的材料每组设有五个平行试样。

1.6 扫描电子显微镜表征

扫描电子显微镜(SEM)(JSM-7100F，日本电子株式会社)表征测试选择φ5 mm×3 mm的骨水泥粒，小粒在空气中放置一周后进行SEM试验。观察其表面形貌。

1.7 降解试验

降解实验同样采用φ5 mm×3 mm的骨水泥粒，α-TCP占比不同的材料每组设有八个平行试样，以PBS缓冲液为降解液，利用集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101SZ，巩义市科瑞仪器有限公司)对其进行恒温振荡(90 r/min)，测试时间为12周，分别对2、4、6、8、10、12周的结果进行分析，以材料失重率的形式显示，计算失重率后对材料进行SEM观察。

动态加载实验中的材料亦做降解实验，实验方式同上。

1.8 X射线衍射分析

将降解2周的复合材料静置，待干燥后通过X射线衍射仪(DX-2700BH，丹东浩元仪器有限公司)，设置步宽角度为0.05°对材料成分进行分析。

1.9 细胞增殖检测

细胞实验以CCK-8实验为主。α-TCP占比不同的材料每组设有4个平行试样，一共3组，置于3个96孔板中。首先将培养好的细胞稀释至2.5×105个/mL，制成细胞悬液，每个材料上加200 μL细胞悬液，分别培养2、4、6天，则细胞可接种于96孔板的材料上，之后将培养2、4、6天的96孔板分别取出，在每个比例材料中加入10 μL的CCK-8，继续培养4 h，最后将150 μL的上清液移入新的96孔板，将上清液振荡后放入酶标仪，在450 nm处测试其吸光度。最终结果通过观察细胞培养上清液的吸光度显示。

2 结果与讨论

2.1 凝固时间

骨水泥的最佳凝固时间为5～30 min，若时间过短，在材料注射过程中材料就会凝固在注射管内；若时间过长，当材料到达骨缺损部位后短时间内难以塑形，可能会引起受损部位感染。由骨水泥的凝固时间结果柱状图(图3)可得，当α-TCP占比为100%时，平均凝固时间为36 min左右，相比骨水泥最佳凝固时间过长；α-TCP占比为95%时，平均凝固时间为7min左右；α-TCP占比为90%、85%时，其平均凝固时间在10min左右，较为适中；α-TCP占比为80%，75%时，凝固时间﹤5min，相比骨水泥最佳凝固时间过短。

图3 不同比例的复合骨水泥的平均凝固时间Fig 3 Average setting time of composite bone cement with different proportion

2.2 静态力学测试

对材料进行静态力学测试旨在检测材料在注射入人体后所能承受的最大压强，由结果柱状图4(a)可得，当α-TCP占比为95%时，其可承受最大的压强为2.7MPa，其次为α-TCP占比为85%的复合材料。因此，材料的力学性能适用于非负重区的骨修复。

图4 静态力学测试与动态力学测试Fig 4 Static mechanics test and dynamic mechanics test: (a) compressive strength of composite bone cement with different proportions under static loading; (b) dynamic loading waveform of different proportion composite bone cement

2.3 动态力学测试

对α-TCP占比不同的复合材料进行循环加载，加载波形及大小如图4(b)所示，此波形可近似模拟人站立行走时胫骨关节所受的力[18]。由于α-TCP占比不同，其在静态载荷下可承受的最大压力不同，在动态载荷下可承受的压力也不同，所以对不同的材料设计的波形压力最大值也不同。其中α-TCP占比为95%的复合材料可承受压力的峰值最大，可达200N，α-TCP占比为100%的复合材料可承受压力的峰值最小。

2.4 降解实验

图5(a)为不同比例未加载复合材料降解失重率对比图，降解时间为12周。对于未加载的复合材料，其在降解实验中，当α-TCP占比为75%时，材料发生质量损失，当α-TCP占比为80%、85%、90%、95%、100%时，材料几乎没有失重。但相比而言，失重率在上下波动，说明复合材料一方面进行降解，一方面发生水化，其水化过程主要是α-CSH作为非均匀形核的基底引起的磷酸三钙晶体形成。在PBS缓冲液的作用下复合材料吸收其钙磷原子发生原子重排，使HA晶体得以生长，降解过程与水化过程发生动态协调。但当α-CSH含量过多时，在液体环境中易发生溃散，导致复合材料发生质量损失。

图5(b)为不同比例复合材料在未加载及加载动态载荷情况下降解两周的失重率对比。当材料经过动态加载以后，复合材料的失重率相比未加载增大，说明动态载荷会影响材料的降解，使降解速度加快。

图5 降解失重率对比Fig 5 Comparison of degradation weight loss rate: (a) comparison of degradation weight loss rate of unloaded composites with different proportion; (b) comparison of weight loss rate of different proportion composites under unloaded and dynamic loading after 2 weeks

2.5 扫描电镜表征

图6为未加载荷的复合材料电镜形貌图。图6(a)～(f)分别为α-TCP占比为100%、95%、90%、85%、80%、75%的复合骨水泥材料降解0、6、12周的形貌图。在降解0周时，复合材料均为无规则状，在发生降解后，复合材料SEM表征为板片状结构，说明复合材料在降解过程中，晶体沿六方晶系中c轴进行生长[9-11]，逐渐形成人体内HA晶体结构，与降解实验中材料的失重率结果形成呼应，表明材料在降解过程中以α-CSH为基，发生了水化。

图6 未加载荷复合材料降解0、6、12周形貌图Fig 6 Characterization of 0, 6, 12 weeks degradation of unloaded composites

2.6 X射线衍射结果

图7为复合材料在降解两周后的XRD谱图。由标准卡可知，HA的特征衍射峰主要出现在2θ=25.86°，28.93°，31.75°，32.17°，34.05°，46.68°，50.49°，53.17°，α-TCP的特征衍射峰主要出现在2θ=27.76°，31.02°，34.37°，46.98°，52.94°。由图可知复合材料在降解过程中，始终有α-TCP的衍射峰，说明α-TCP可部分水化形成HA。当α-TCP占比为100%、90%时，复合材料的XRD谱图中HA的最高衍射峰较弱，说明材料呈弱结晶状态，当α-TCP占比为85%时，HA的衍射峰出现频率最高，随着α-CSH含量增加，复合材料的衍射峰数量减少，峰值也有所减弱，说明α-CSH的加入增大了钙磷比例，使得材料更易向HA转化。

图7 复合材料的XRD谱图Fig 7 XRD patterns of composite materials

2.7 CCK-8实验结果

实验结果以材料吸光度(图7)显示，培养液吸光度增加，则细胞增殖。如图7所示，材料在接种细胞培养2、4、6天后，培养液的吸光度逐渐增加，说明细胞处于增殖的状态，证明复合材料生物相容性良好，但α-TCP占不同比例的复合骨水泥材料其吸光度并无显著性差异。

图8 不同比例复合骨水泥细胞吸光度对比Fig 8 Comparison of cell absorbance of different proportion of composite bone cement

3 结论

由凝固时间实验可知，α-TCP占比为95%、90%、85%的复合材料降解时间在5～30 min，满足骨水泥最佳凝固时间的要求。在静态加载与动态循环加载实验中，可承受压力最大的材料α-TCP占比为95%，其可承受最大静态压强为2.7 MPa。在降解实验中，本实验认为材料的增重是磷酸钙的水化过程与硫酸钙降解过程的不断协调平衡导致的，α-TCP以α-CSH为基从外到内进行层层降解并水化，内部的水化对于Ca、P原子的摄取来自于上一层复合材料以及PBS缓冲液中的Ca、P原子，导致了材料表面的晶体不断生长，形态不断改变，最终出现板状缠结晶体结构。在XRD衍射分析中可知，α-TCP在降解水化的过程中会部分转化为HA，当α-TCP占比为85%时，HA的衍射峰出现频率最高。在细胞吸光度的检测中可以看出，复合材料都是生物相容性良好的材料。