不同生长期壁虎水取物对肝癌细胞Bel-7402增殖抑制及诱导分化活性的影响

王慧慧，孙艺茹，陈心怡，位雪，谢雪晴，王春梅

（北京中医药大学生命科学学院，北京 100029）

壁虎又称天龙、守宫、蟾蛇，包括多疣壁虎（Gekko japonicus Dumerilet Biron）、蹼趾壁虎或无蹼壁虎（Gekko swinhonis Guenther）及其他几种壁虎的干燥全体，其中无蹼壁虎产于我国东北与华北[1-3]。壁虎作为传统中药始载于《本草纲目》，《四川中药志》称其具有“驱风，破血积包块，治肿瘤”之功效[4]。近年来也在临床得以广泛应用，尤其对消化系统癌症、神经系统疾病、结核病和骨髓炎等卓有疗效，毒副作用小[5]。壁虎以其显著的疗效已广泛用于多种癌症的临床治疗，如以鲜守宫入药的金龙胶囊，可用于治疗原发性肝癌、大肠癌和食道癌等多种癌症；后续有研究表明，壁虎其可提高艾滋病患者的免疫力，提高患者的存活率[6]；以中药壁虎入药的牛黄天龙胶囊可通过调节免疫系统发挥抗肿瘤作用，对子宫内膜癌和宫颈癌有显著疗效[7]；由壁虎与其他传统中药配成的香龙散含药血清通过诱导癌细胞凋亡治疗胃癌[8]。与此同时，壁虎的人工养殖也越发成熟，但考虑综合养殖成本，对其最佳入药采收时期未有明确研究。此前已有大量研究表明植物类中药材活性与其采收期密切相关[9-11]，动物药相关研究较少。

碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）广泛分布于人体的骨、肝、肠及胎盘等组织中，患阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌和胆汁淤积性肝炎时，肝细胞会过度制造ALP，因此ALP活力检测已发展成为上述疾病的常规检查指标[12]。本课题组前期[13]发现壁虎水提粗蛋白体内外抗肿瘤活性一致性较好，其发挥抗肿瘤活性途径之一是诱导肿瘤细胞分化，且ALP活力与癌细胞分化活性具有直接相关性。因此本实验比较5种生长期壁虎水提物可溶性蛋白分子量分布及含量，体外实验MTT法检测水提物癌细胞增殖抑制活性，并检测用药后癌细胞ALP活力指标变化，以此反映肿瘤细胞分化状态，共同表征壁虎的抗肿瘤活性，为确定最佳入药采收时机提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 鲜壁虎

无蹼壁虎鲜品，购自山东济南市中九顶山天然养殖场，由北京中医药大学张冰教授鉴定。

1.2 细胞株

Bel-7402人肝癌细胞株，购买于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，由北京中医药大学生物制药系保存。

1.3 仪器

恒温干燥箱（上海一恒），低温高速离心机（Sigma），高速万能粉碎机（泰斯特，FW800），紫外分光光度计（Ultraviolet-2100型，上海龙尼柯），垂直电泳槽（Bio-Rad），酶标仪（EPOCH,Biotek,USA），倒置显微镜（Nikon Eclipse TE2000,Japan）。

1.4 试剂

SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（北京索莱宝），BCA蛋白定量试剂盒（北京兰博利德），ALP定量试剂盒（北京兰博利德），RPMI-1640培养基（Gibco,Life Technologies,USA），噻唑蓝（MTT）、牛血清白蛋白和二甲基亚砜（DMSO,Sigma,USA）；Tris、氨苄青霉素、链霉素（拜耳迪生物技术有限公司）。

2 方法

2.1 壁虎水提物的制备

以置于﹣80℃超低温冰箱保存的新鲜壁虎为实验材料。称取相同克重的壁虎化冻，用粉碎机匀浆后按照壁虎和蒸馏水比为1∶4（w/v）制得匀浆液。匀浆液于﹣80℃和20℃条件下反复冻融5次，破裂组织细胞得壁虎组织液。组织液通过4层纱布过滤除大块组织，双层滤纸抽滤去除部分油脂和沉淀物，取滤液在12 000 rpm、20 min、4℃条件下高速离心，收集上清液，先后经0.45m、0.22m滤膜除菌4℃保存备用，制得生药量0.25 g mL-1鲜壁虎水提粗蛋白。3月龄、5月龄、8月龄、1年龄和3年龄壁虎组别分别命名为I、II、III、IV、V组别。

2.2 水溶性蛋白质浓度及多样性测定

按照BCA法蛋白定量试剂盒说明书测定水溶性蛋白质浓度。采用SDS-PAGE法测定水溶性蛋白质多样性差异，上样样品稀释至1 mg mL-1，分离胶浓度设为10%，浓缩胶浓度为5%。

2.3 MTT法评估各样品抑制Bel-7402细胞增殖活性

将指数生长期的Bel-7402细胞（单位体积细胞个数为3 104/mL，每孔100L）接种到96孔板中，使细胞自然生长24 h，后暴露于100L各浓度稀释样品中。I、II、III、IV加药组分别用相应比例的蒸馏水、5 RPMI-1640培养基及FPS将水提物稀释为2～50倍的活性待测液作用于Bel-7402细胞，空白对照组Bel-7402细胞使用不含水提物含10%FBS的RPMI-1640培养基培养，置于培养箱孵育24 h、48 h和72 h，37℃、5%CO2，每组3个重复。用倒置显微镜观察并拍照监测形态变化。每孔加入100L含0.5 mg mL-1MTT的PBS再孵育4 h，除去上清液，加入150L DMSO并摇动15 min。使用酶标仪测量570 nm处吸光度。细胞抑制率计算式：抑制率＝（1-A处理/A对照）100%

2.4 比较样品对Bel-7402细胞ALP活力影响

将指数生长期Bel-7402细胞（7 104个/孔）接种到6孔板中，使细胞自然生长24 h后暴露于1 mL/孔各浓度稀释样品中。用前述方法分别配置将I、II、III、IV组水提物稀释为2倍、4倍、6倍、9倍的样品待测液作用细胞，空白对照组更换含10%FPS的RPMI-1640培养基继续培养，24 h后倒掉上清液，用胰酶消化收集细胞，使用ALP定量试剂盒检测Bel-7402细胞ALP活力变化情况。

2.5 统计分析

所有数据采用平均值±标准差表示，采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计分析及t检验进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 不同生长期壁虎外观形态对比

如图1所示，壁虎生长前期的发育主要体现在身体的纵向伸长，随着年龄的增大伸长速度有所衰减，成熟后壁虎主要体现为肢体增粗。从外观看，无蹼壁虎通体呈灰棕色，头、颈、躯干、尾及四肢均有深或浅的色斑，颈及躯干背面形成6～7条横斑，尾背面形成11～14条横斑，其深浅程度和花纹与生活环境相关，本实验样品未见花纹深浅与年龄有密切相关性。如表1数据所示，3月龄幼体壁虎体长介于6～6.5 cm，5月龄幼体壁虎体长介于9～9.5 cm，8月龄亚成体壁虎体长介于11～11.5 cm，8月龄后伸长速度显著减慢但横宽明显增大。1年龄成体壁虎体长介于11.5～12 cm，此后身长增长趋于停滞，主要体现在头部比重增大。

图1 不同生长期无蹼壁虎长度及外观形态Fig.1 Appearances of Guenther with different growth stages

表1 不同生长期无蹼壁虎壁虎体长和体重（，n=10）Table 1 The length and weight of Guentherwith different growth stage（s，n=10）

表1 不同生长期无蹼壁虎壁虎体长和体重（，n=10）Table 1 The length and weight of Guentherwith different growth stage（s，n=10）

组别 Group 体长（cm）Lengh 体重（g）Weight Group I 6.35±0.20 0.66±0.15 Group II 9.23±0.15 1.25±0.10 Group III 11.37±0.15 2.50±0.13 Group IV 11.77±0.15 5.10±0.10 Group V 12.30±0.15 6.20±0.12

3.2 样品水溶性蛋白质浓度和多样性随年龄增大而降低

如图2 c，随着壁虎体型的不断增大，其水溶性蛋白质含量有所降低。3月龄（I）和5月龄（II）水提物中水溶性蛋白质含量最高可达12.58 mg mL-1，5月龄（II）之后同等生药量水提物样品水溶性蛋白含量显著下降（P＜0.001）。

在蛋白多样性变化方面，如图2 a、2 b红框标示区域，不同生长期壁虎可溶性蛋白分子量大小分布有明显差异。各组上样样品为相同生药量时（图2 a），随着生长期延长蛋白条带数减少，分子量分布多样性降低，其中15～25 kD蛋白条带溶出减弱最为明显。将上样蛋白质浓度调整至相同后（图2 b），发现3个分子量区间蛋白质条带的变化较为明显：随着生长期的延长，35 kD左右蛋白条带和15～25 kD区域蛋白条带减少甚至消失，而区间40～60 kDa蛋白质条带灰度加深，特别是45kD左右，表明该分子量区间蛋白所占比重增加。另外，含量最高的蛋白质始终集中在40～60 kDa及10～15 kDa区域。结果表明，壁虎机体成熟伴随着某些水溶性蛋白的持续衰减，使另一部分蛋白质比重相对增高。

图2 不同生长期壁虎水提物中可溶性蛋白的浓度和蛋白分子组成差异Fig.2 Concentration and component difference of soluble proteins in AG of Guenther with different growth stages

3.3 不同生长期壁虎对人肝癌细胞Bel-7402体外增殖抑制差异

5种生长期壁虎的不同浓度水提物分别作用于Bel-7402细胞24 h（图3 a）、48 h（图3 b）和72 h（图3 c）后皆表现出时间和浓度正相关增殖抑制活性。壁虎生长至8月龄（III）后细胞增殖抑制活性开始显著高于3月龄（I）和5月龄（II），且该差距与用药浓度负相关，用药浓度越低该差距越明显。

在同一浓度下，3月龄（I）和5月龄（II）组对Bel-7402细胞的增殖抑制作用没有统计学差异（P＞0.05），8月龄（III）、1年龄（IV）和3年龄（V）组没有统计学差异（P＞0.05），见图3。该统计学差异结果与相同生药量可溶性蛋白含量相一致，说明5～8月龄之间是壁虎的迅速生长期，8月龄之后壁虎生长变化趋于稳定，抑制率最高可达88.94%±6.68%（IV/72h），在同一条件下，3月龄（I）和5月龄（II）组抑制率仅为41.89%±3.85%（I）和39.97%±4.66%（II）。

图3 用药24 h（a）、48 h（b）、72 h（c）后5种生长期壁虎水提物对人肝癌Bel-7402细胞的增殖抑制影响（，n=3）Fig.3 The proliferation inhibition activity of five kinds of AG(aqueous extracts of fresh gecko)on Bel-7402 cells was evaluated by MTT assays with the same crude drug content for 24 h(a),48 h(b),72 h(c).（，n=3）

3.4 不同生长期壁虎对Bel-7402细胞ALP活力抑制差异

不同浓度不同生长期壁虎水提物作用癌细胞24 h后，表现出不同程度地对Bel-7402细胞ALP活力的浓度相关性抑制，8月龄（III）及以上成体壁虎的水提物具有更强的ALP活力抑制活性（图4）。3月龄（I）与5月龄（II）组在稀释至9倍时，细胞ALP活力与空白组无统计学差异，其余样品组均与空白对照组存在显著性差异（P＜0.05）。当用药浓度最高时，III、IV、V组细胞ALP活力降为61.76±5.64 Kat、52.16±9.68 Kat、56.18±4.73 Kat，与III组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；对Bel-7402细胞增殖抑制率分别为52.62%、59.98%和56.90%，相同浓度无统计学差异。壁虎水提物对Bel-7402细胞ALP活力抑制在8月龄达到最强，后并无显著增强。

图4 用药24 h后不同生长期壁虎对Bel-7402 ALP活性的影响Fig.4 Effects of different growth stages of Gecko on the ALP activity of Bel7402 cells for 24 h

4 讨论

动植物中药的采收时机对其活性影响较大，目前多以药用活性成分的含量评价其最佳采收期。如野葛的总异黄酮含量与生长时长成正比，后期较初期含量可增加53%，其抗氧化活性也随之增大，12月份时达到峰值[14]；对忍冬叶不同生长期9种活性成分定量研究显示，6月份抗菌活性最好，为其最佳采收期[15]。对动物药采收时期与活性关系也进行了一些探索，如传统全身入药动物药地龙夏、秋季体型达峰值后，其体内降血压活性成分血小板活化因子含量最高[16]；入药全蝎的蝎龄越大牛磺酸含量越高，且养殖品种优于野生品种[17]；日本医蛭在夏、秋成体时收获入药，抗凝血酶含量最高，不低于120 U g-1[18]；中国林蛙，其最佳入药体为经过两年生长期25 g以上的成蛙[19]。由此可见，作为药用动物采收时机对其药用价值的影响较大，随着动物药养殖产业的发展，最佳采收期成为值得研究的问题。

本课题组[13]前期已通过体内外实验证明鲜壁虎水提肽类物质具有高抗肿瘤活性及体内外活性一致性，Bel-7402细胞活性与其ALP活力具有正相关性，可由此评估癌细胞分化抑制程度。本实验选取5种生长期壁虎制备水提物进行比较，结果显示，5月龄前的幼年壁虎可溶性蛋白含量相对较高，主要由于生长前期脂肪积累程度低，随着年龄的增长，壁虎可溶性蛋白含量和种类逐渐减少，主要表现在15～20 kDa和30～35 kDa分子减少（图2），区间40～60 kDa蛋白含量增加，活性蛋白是否位于此区段有待进一步研究。体外MTT实验结果和Bel-7402细胞ALP活性变化显示，壁虎生长至8月龄（III）后，抗肿瘤活性达到最高且继续成熟后无显著性差异变化，体外增值抑制率表现出浓度和时间相关性，最高可达88%左右。考虑到养殖成本与养殖时长成正比，无蹼壁虎生长至8月龄时入药，可发挥抗肿瘤药性。