党参多糖对溃疡性结肠炎大鼠结肠上皮NF-κB 信号通路的影响

刘雪枫乔 婧高建德 陈正君刘 雄*

（1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中藏药化学与质量研究省级重点实验室，甘肃兰州 730000；3.甘肃省中药质量与标准研究重点实验室，甘肃 兰州 730000）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种多因素导致的原因不明的慢性炎性肠病之一，以腹泻、腹痛、血便为主要临床症状，近年来发病率明显升高、发病人群趋于年轻化［1-2]，是世界卫生组织公认的难治性疾病之一，易反复发作［3]。目前常用治疗药物包括水杨酸类、皮质激素类、免疫抑制剂等，但均不能根治UC 的发作，且不良反应较多。近年来，中药以多靶点、多组分的特点，已成为UC 的重要治疗药物。

党参为桔梗科党参 Codonopsis pilosula（Franeh.）Nannf.、素花党参 Codonopsis pilosula Nannf.Var.modesta（Nannf.）L.T.Shen 或川党参Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根，主要有效成分为党参皂苷、党参多糖等，具有补中益气、健脾益肺的功效，临床上常用于治疗脾肺气虚、咳嗽虚喘、内热消渴等症［4]，相关方剂广泛应用于发作期、缓解期溃疡性结肠炎的治疗［5]。研究表明，党参多糖具有明显的抗氧化、免疫调节作用［6]。本实验探讨党参多糖对溃疡性结肠炎大鼠的保护作用，并通过NF-κB 信号通路探讨其可能作用机制，为该成分利用提供一定理论依据。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雄性Wistar 大鼠50 只，体质量（220±10）g，由甘肃中医药大学动物实验中心提供，动物合格证号NO.62001000000208，使用许可证号SYXK（甘）2015-0005，在温度22～24 ℃、相对湿度40%～60%下以普通饲料喂养。

1.2 试剂与药物 党参购于兰州复兴厚中药饮片有限公司，批号20180319，经甘肃中医药大学王明伟副教授鉴定为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.的根。柳氮磺胺吡啶（SASP，上海信谊天平制药厂，批号180625）；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，天津大茂化学试剂厂，批号180402）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为20180514、20180522）；白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子（TNF-α）酶联免疫法（ELISA）检测试剂盒（江苏酶免生物科技公司，批号分别为0190R2、0195R2、0180R2）；RNA 提取试剂盒、cDNA 反转录试剂盒、实时荧光定量PCR 检测试剂盒（德国Qiagen 公司，批号分别为157042224、160017598、157056248）；小鼠SP试剂盒、兔SP试剂盒、DAB 显色试剂盒（北京中杉金桥科技有限公司，批号分别为SP-9002、SP-9001、ZLI-9018）；NFκB 一抗（美国Genetex 公司，批号GTX107678）；IL-6、IL-10、TNF-α 引物序列均由上海生工生物公司合成，见表1。水合氯醛（郑州市德众化学试剂厂，批号181204505）；多聚甲醛、中性树胶、伊红、苏木素（北京索莱宝科技有限公司，批号分别为G7301、G8590、G070、G080）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 仪器 Primo 高速离心机（德国Heraeus 公司）；5424R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；KD-BM 包埋机（浙江省金华市科迪仪器有限公司）；切片机（德国徕卡公司）；iMark 酶标仪（美国Bio-Rad 公司）；NanoDrop 核酸浓度测量仪（美国Thermo 公司）；DM7500 实时定量PCR 仪（美国Agilent 公司）；ImageQuant 400 凝胶成像系统（英国GE Healthcare 公司）；RX50 显微镜（宁波舜宇仪器有限公司）；AE-240 电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。

2 方法

2.1 药物制备 取粉碎药材500 g，加3 倍体积石油醚回流脱脂2 次，加入3 倍体积95%乙醇，回流提取6 h，弃去提取液，重复3 次，滤渣60 ℃恒温干燥，加入蒸馏水，以固液比1∶10 提取3 次，每次1 h，合并提取液，并加入无水乙醇使其含醇量达到80%，低温静置24 h，沉淀真空干燥，即得党参多糖，得率为16.39%。经Savage 法脱蛋白后，以苯酚-硫酸法测得多糖质量分数为90.21%。

2.2 分组、建模及给药 50 只大鼠适应性喂养后，按体质量随机分为5 组，每组10 只，分别为正常组，模型组，SASP 阳性对照组（0.3 g/kg）及党参多糖高、低剂量组（9、3 g/kg，按生药量计算，为成人临床剂量的30、10 倍），正常组和模型组灌胃等体积蒸馏水，其余各组给予相应药物灌胃，每天1 次，连续5 d。大鼠禁食36 h，水合氯醛麻醉，正常组以生理盐水灌肠，其余各组均以TNBS/乙醇溶液灌肠，具体方法参考文献［7]。造模后，连续3 d 监测疾病活动指数（DAI），DAI＞0.5 表明造模成功，继续给药21 d。

2.3 一般行为及DAI 评分 给药期间，观察大鼠精神状态、进食情况、毛色光泽、腹泻、黏液便、血便等一般情况，进行DAI 评分，见表2，计算公式为DAI=（体质量下降评分+粪便性状评分+大便隐血评分）/3。

表2 DAI 评分Tab.2 DAI scores

2.4 结肠黏膜损伤指数（CMDI）评分 末次给药30 min 后，大鼠禁食不禁水36 h，水合氯醛麻醉后解剖，取从肛门向上至8 cm 处的结肠组织，纵向剖开，生理盐水洗净，平铺固定观察结肠黏膜大体形态改变：0 分，无损伤；1 分，轻度充血，水肿，表面光滑，无糜烂或溃疡；2 分，充血水肿，黏膜粗糙呈颗粒状，有糜烂或肠粘连；3 分，高度充血水肿，黏膜表面有坏死及溃疡形成，溃疡最大纵径小于1.0 cm，肠壁增厚或表面有坏死及炎症；4 分，在3 分基础上溃疡最大纵径大于1.0 cm或大鼠死亡。

2.5 苏木精-伊红（HE）染色 将1 cm 大鼠结肠组织，PBS 漂洗干净后4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋切片，HE 染色，光镜下观察组织病理学形态变化。

2.6 结肠组织中生化指标检测 取适量大鼠结肠组织，生理盐水制成10% 匀浆，离心取上清后，按照试剂盒方法检测SOD 活性和MDA 水平。

2.7 ELISA 法检测UC 大鼠结肠组织中IL-6、IL-10、TNF-α 水平 取适量大鼠结肠组织，加入生理盐水制成10%匀浆，离心取上清，按照ELISA 试剂盒使用书测定IL-6、IL-10、TNF-α 水平。

2.8 实时荧光定量-聚合酶链式反应（RT-PCR）法测定IL-6、IL-10、TNF-α mRNA 表达 取适量大鼠结肠组织，加入液氮研磨，按照RNA 提取试剂盒说明书提取RNA，采用多功能酶标仪测定样品浓度。在PCR 扩增仪上将RNA 逆转录为cDNA，之后进行RT-PCR 反应，反应条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸5 min，共40 个循环。应用2-ΔΔCT方法计算各基因相对表达，重复3 次。

2.9 免疫组化法观察结肠组织中NF-κB 表达 切取3 mm 大鼠结肠组织，石蜡包埋后切制成5 μm切片，常规脱蜡，梯度70% 乙醇水化，柠檬酸钠热修复2 次，3% 过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，山羊血清封闭液封闭30 min，每张切片滴加一抗NF-κB（1∶200），4 ℃冰箱过夜，PBS 冲洗后滴加聚合HRP 标记抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗后DAB 显色10 min 左右，室温下苏木素复染90 s，自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各反应25 min，中性树胶封片。显微镜观察结肠组织中NF-κB 表达情况，Image J 软件统计蛋白表达量。

2.10 蛋白免疫印迹法（Western blot）测定结肠组织中NF-κB 蛋白表达 取适量大鼠结肠组织，加入适量蛋白裂解液匀浆，3 500 r/min 离心15 min，取上清，BCA 法检测蛋白浓度，并将其调整为4 μg/μL，加热变性后-80 ℃保存。在制胶、上样10 μL、电泳、湿转法转膜、5% 脱脂奶粉封闭、一抗4 ℃过夜、二抗孵育1 h 后，加入ECL 化学发光液，立即进行蛋白化学发光并获取图像，以β-actin 为内参，Image J 软件计算灰度值。

2.11 统计学分析 通过SPSS 19.0 软件进行处理，数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差齐者用LSD 法，不齐者用Games-Howell 法检验。 P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 党参多糖对UC 大鼠一般行为及DAI 评分的影响 造模后，除正常组外，其余大鼠均出现体质量下降、懒动、竖毛、厌食症状，有明显腹泻，甚至出现便血，DAI 评分升高（P＜0.01）。给药后，正常组大鼠一般情况良好，自主活动正常，饮食正常，毛色有光泽，无腹泻便血发生；模型组大鼠出现懒动，竖毛，厌食症状，有腹泻发生，甚至出现便血，体质量降低；党参多糖高、低剂量组大鼠一般情况较模型组好，毛色有光泽，自主活动增加，腹泻发生率低于模型组，同时各给药组DAI 评分下降（P＜0.05，P＜0.01），见表3。

3.2 党参多糖对UC 大鼠CMDI 评分的影响 正常组大鼠结肠颜色淡红，表面光滑，肠壁厚薄适中，黏膜皱襞清晰完整；模型组大鼠肠壁红肿充血，溃疡明显，溃疡面积较对照组扩大（P＜0.01）；党参多糖组大鼠亦可见结肠水肿、充血或黏膜粗糙，但较模型组有明显改善（P＜0.05，P＜0.01）。CMDI评分见表3。

表3 UC 大鼠DAI、CMDI 评分（，n=10）Tab.3 DAI and CMDI scores for UC rats（，n=10）

表3 UC 大鼠DAI、CMDI 评分（，n=10）Tab.3 DAI and CMDI scores for UC rats（，n=10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.3 党参多糖对UC 大鼠结肠组织形态学的影响图1 显示，正常组大鼠染色均匀，细胞核形态正常，肠黏膜及基层清晰可见；与正常组比较，模型组大鼠有大量炎性细胞浸润，黏膜层损伤严重，基层分界线消失；与模型组比较，SASP 组大鼠炎性细胞浸润减少，黏膜损伤较轻；与模型组比较，党参多糖组大鼠炎性细胞减少，黏膜层损伤较轻，基层较清晰。

图1 党参多糖对UC 大鼠结肠组织形态学的影响（HE，×200）Fig.1 Effect of CPPs on the colonic histomorphology of UC rats（HE，×200）

3.4 党参多糖对UC 大鼠结肠组织中SOD 活性和MDA 水平的影响 如表4 所示，与正常组比较，模型组大鼠结肠黏膜组织SOD 活性降低（P ＜0.01），MDA 水平升高（P ＜0.01）；与模型组比较，SASP 组大鼠结肠黏膜组织SOD 活性升高，MDA 水平下降，差异有统计学意义（P ＜0.01）；与模型组比较，党参多糖组可提高大鼠结肠黏膜中SOD 活性（P＜0.01），降低MDA 水平（P＜0.01），高剂量组效果略优于SASP 组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 党参多糖对UC 大鼠结肠组织中SOD 活性、MDA水平的影响（，n=10）Tab.4 Effects of CPPs on colonic SOD activity and MDAlevel of UC rats（，n=10）

表4 党参多糖对UC 大鼠结肠组织中SOD 活性、MDA水平的影响（，n=10）Tab.4 Effects of CPPs on colonic SOD activity and MDAlevel of UC rats（，n=10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

3.5 党参多糖对UC 大鼠结肠组织中IL-6、IL-10、TNF-α 水平的影响如表5 所示，与正常组比较，模型组大鼠结肠组织中IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.01），IL-10 水平降低（P＜0.01）；与模型组比较，SASP 组和党参多糖高、低剂量组大鼠结肠组织中IL-6、TNF-α 水平降低（P ＜0.05，P ＜0.01），IL-10 水平升高（P＜0.01），高剂量组效果优于SASP 组和党参多糖低剂量组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表5 党参多糖对UC 大鼠结肠组织中IL-6、IL-10、TNFα 水平的影响（，n=10）Tab.5 Effects of CPPs on the levels of IL-6，IL-10 and TNF-α in colon tissue of UC rats（，n=10）

表5 党参多糖对UC 大鼠结肠组织中IL-6、IL-10、TNFα 水平的影响（，n=10）Tab.5 Effects of CPPs on the levels of IL-6，IL-10 and TNF-α in colon tissue of UC rats（，n=10）

注：与正常组比较，** P ＜0.01；与模型组比较，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.6 党参多糖对UC 大鼠结肠组织中IL-6、IL-10、TNF-α mRNA 表达的影响如表6所示，与正常组比较，模型组大鼠结肠组织IL-6、TNF-α mRNA 表达升高（P ＜0.01），IL-10 mRNA 表达降低（P ＜0.01）；SASP 组较模型组抑制 了IL-6、TNF-α mRNA 表达，提高了IL-10 mRNA 表达（P＜0.05）；给予党参多糖高、低剂量组干预后，IL-6、TNF-α mRNA 表达较模型组降低（P＜0.01），IL-10 mRNA表达升高（P＜0.01）。

表6 党参多糖对UC 大鼠结肠组织中IL-6、 IL-10、 TNFα mRNA 表达的影响（，n=10）Tab.6 Effects of CPPs on the mRNA expressions of IL-6，IL-10 and TNF-α in the colon tissue of UC rats（，n=10）

表6 党参多糖对UC 大鼠结肠组织中IL-6、 IL-10、 TNFα mRNA 表达的影响（，n=10）Tab.6 Effects of CPPs on the mRNA expressions of IL-6，IL-10 and TNF-α in the colon tissue of UC rats（，n=10）

注：与正常组比较，** P ＜0.01；与模型组比较，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.7 党参多糖对UC 大鼠结肠组织中NF-κB 表达的影响 如图2、表7 所示，与正常组比较，模型组大鼠结肠黏膜中NF-кB 表达升高（P ＜0.01），SASP 组较模型组减少（P＜0.05）；与模型组比较，党参多糖高、低剂量组均能减少NF-кB 表达（P＜0.01），并与给药剂量呈正相关；党参多糖高剂量组作用比SASP 组更显著（P ＜0.01）。如图3 所示，与正常组比较，模型组大鼠结肠组织中NF-кB p65 蛋白表达升高（P＜0.01）；SASP 组NF-кB p65蛋白表达降低（P＜0.05），党参多糖高、剂量组抑制了NF-кB p65 蛋白表达，差异均具有统计学意义（P＜0.01），与免疫组化结果一致。

表7 党参多糖对UC 大鼠结肠组织中NF-κB 蛋白表达的影响（，n=3）Tab.7 Effect of CPPs on the expression of NF-κB protein in the colon tissue of UC rats（，n=3）

表7 党参多糖对UC 大鼠结肠组织中NF-κB 蛋白表达的影响（，n=3）Tab.7 Effect of CPPs on the expression of NF-κB protein in the colon tissue of UC rats（，n=3）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与SASP 组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

图2 各组大鼠结肠组织中NF-κB 蛋白表达（×200）Fig.2 NF-κB protein expressions in rat colon tissue in various groups（×200）

图3 各组大鼠结肠组织中NF-κB p65 蛋白表达Fig.3 NF-κB p65 protein expressions in rat colon tissue in various groups

4 讨论

UC 发病机制是多因素的，包括遗传易感性、上皮屏障缺陷、免疫反应失调、环境等［1]，其病程发展可导致纤维化的形成，甚至出现癌变，因此，寻找UC 的有效治疗药物愈来愈受到关注。中药因其作用靶点多、安全性高等特点，在临床治疗UC 中体现出了独特的优势，裴银奇等［7]对治疗溃疡性结肠炎的处方进行统计后发现，党参出现频次在100 次以上。党参是传统的补益中药，也是甘肃省道地药材，具有健脾益肺、养血生津之效［8]，党参多糖是采用水提醇沉法从党参中提取出的有效部位，可调整微生态失调，促进肠道有益菌的生长增殖并抑制肠道潜在致病菌［9-10]，能显著缓解葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎，且效果明显优于复方四君子汤［11]。

人类溃疡性结肠炎结肠黏膜中氧化应激失衡，产生的大量自由基损伤机体自身组织或激活炎症介质，可使结肠炎症的损伤加剧［12-13]。MDA 是由自由基引起脂质过氧化反应的终产物，其量与自由基含有量和脂质过氧化程度成正比［14]；SOD 是体内消除超氧阴离子的抗氧化酶系，具有清除自由基、抑制脂质过氧化反应的作用，同时能修复受损细胞［14]。当多种危险因素刺激肠道黏膜时，造成肠道功能失调、机体氧化应激失衡，产生的大量自由基引起脂质过氧化反应，导致机体内MDA 水平的升高，SOD的耗竭；同时大量自由基的产生又会导致炎症介质的释放，从而进一步造成结肠组织损伤而发生UC。本实验发现，党参多糖能显著降低UC 大鼠结肠组织中MDA 水平，提高SOD 活性，说明它能抑制脂质过氧化反应的发生，改善结肠黏膜损伤。

肠道炎性细胞因子异常表达是UC 的重要机制之一［15]，而UC 炎症因子的产生又与TLRs/NF-κB通路有密切关系［16]。核因子κB（NF-κB）是炎症反应期间被激活的主要转录因子之一，当炎症或免疫反应发生时，NF-κB 从细胞质进入细胞核内，调控炎性细胞因子的表达，包括IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等［17-18]。IL-6 是由单核细胞、巨噬细胞及T细胞分泌的一种辅助型T 细胞（Th）Ⅰ型细胞因子，能够诱导中性粒细胞的分泌和增殖，是具有广泛生物活性的促炎细胞因子，能直接介入急性期炎症损伤过程，在UC 的发病过程中扮演重要角色［19]。TNF-α 是一类由单核巨噬细胞产生的一种肽类物质，能刺激中性粒细胞和单核巨噬细胞等合成IL-1、IL-6、IL-8 等细胞因子，在IL-6 的参与下，还可激活磷脂酶，继而生成白三烯和氧自由基等［20]。IL-10 又名细胞因子合成抑制因子，能抑制中性粒细胞和自然杀伤细胞产生促炎性细胞因子和趋化因子，抑制IL-6、TNF-α 等的产生［19]。本研究结果显示，用TNBS 联合乙醇造模后，模型组大鼠结肠组织中NF-κB 蛋白表达显著升高，IL-6、TNF-α 水平及mRNA 表达升高，IL-10 水平 及mRNA 表达降低；给予党参多糖后，NF-κB 蛋白表达明显降低，IL-6、TNF-α 水平及mRNA 表达下降，而IL-10 水平及mRNA 表达升高。说明党参多糖能抑制NF-κB 信号通路，减少促炎因子IL-6、TNF-α 的释放，增加抑炎因子IL-10 的释放。

综上所述，党参多糖对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜具有保护作用，其机制可能抑制NF-κB 信号通路的活化，减少IL-6 和TNF-α 等炎性因子的释放，并增强IL-10 的抗炎作用有关。