OTUB2表达下调对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力及PI3K/AKT信号通路的影响*

任舒婷，魏晓巍，任传路△

1.中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院检验科，江苏无锡 214044；2.南京医科大学第二附属医院检验医学中心，江苏南京 210011

胃癌是全球最常见的肿瘤之一，由于早期症状不明显，大多数胃癌患者在确诊时已处于晚期或出现远处转移[1-3]。胃癌致病和转移机制的复杂性和多因素性被认为是降低该病患者生存率的主要原因。目前，迫切需要能早期识别胃癌进展的关键分子标志物，以帮助临床早期治疗，改善患者预后。含OTU结构域的泛素醛结合蛋白2(OTUB2)是一种去泛素化酶，属于卵巢肿瘤超家族蛋白，首次在果蝇卵巢肿瘤基因中被发现[4]。研究表明，OTUB2有广泛的生物学作用,包括防止病毒诱导激活干扰素调节因子3 (IRF3)和核因子-κB(NF-κB)[5],促进人类胰腺胰岛β细胞生存[6],并维持DNA修复途径，促进乳腺癌和肺癌的进展和转移[7-10]。然而关于OTUB2在胃癌发生、发展中的作用尚不清楚。本研究观察了下调OTUB2对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路的影响，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞来源 人胃癌细胞系MGC-803购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

1.2仪器与试剂 ABI Prism 7000荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司，Lipofectamine 2000转染试剂和Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，OTUB2小干扰RNA(si-OTUB2)及其对照si-NC购自上海吉玛制药技术有限公司，PrimeScript RT试剂盒和SYBR Premix ExTaq RT-PCR试剂盒购自日本Takara公司，TaqMan试剂盒购自美国BioVision公司，OTUB2和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，CCK-8试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司，增强化学发光(ECL)试剂盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自上海恒斐生物科技有限公司，基质胶购自美国Thermo公司，兔多克隆抗体OTUB2、增殖细胞核抗原(PCNA)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、AKT、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)和GAPDH购自美国Abcam公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养、转染 所有细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO2的湿化培养箱中培养。使用Lipofectamine 2000转染试剂根据说明书向MGC-803细胞转染si-OTUB2序列(si-OTUB2组)及阴性对照si-NC序列(si-NC组)，另设置空白对照组不做任何转染处理。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测OTUB2的转染情况。

1.3.2RT-qPCR检测细胞中OTUB2 mRNA表达水平 采用Trizol试剂并按照说明书要求提取细胞中的总RNA；采用PrimeScript RT试剂盒反转录合成cDNA；采用SYBR Premix ExTaq RT-PCR试剂盒扩增cDNA；采用ABI Prism 7000荧光定量PCR仪检测mRNA水平。以GAPDH作为内参基因，使用2-ΔΔCt法计算OTUB2 mRNA的表达水平。引物序列，OTUB2：上游引物5′-ACACTTGGAACCGGCTTGAC-3′，下游引物5′-AGCACACGGACTGTCCTGA-3′；GAPDH：上游引物5′-CAGCAAGAGCACAAGAGGAA-3′，下游引物5′-ATGGTACATGACAAGGTGCGG-3′。实验重复3次。

1.3.3Western blot检测细胞中OTUB2蛋白表达水平 转染后从细胞中分离出总蛋白，采用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白表达水平。蛋白标本经12% SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转移到PVDF膜上，在脱脂乳中封闭后加入1∶1 000稀释的一抗OTUB2和GAPDH，并在4 ℃孵育过夜，随后用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗在室温下孵育2 h。利用ECL检测系统观察蛋白质。以OTUB2蛋白条带与内参GAPDH条带灰度值的比值表示OTUB2蛋白的表达水平。实验重复3次。

1.3.4CCK-8法检测细胞增殖情况 按照CCK-8试剂盒说明书，将4 000个处于对数生长期的MGC-803细胞接种到96孔板中，培养96 h。每隔24 h加入CCK-8试剂，然后孵育2 h。使用分光光度计检测450 nm波长处的吸光度(A)值，用于反映细胞的增殖情况。实验重复3次。

1.3.5Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力 细胞迁移实验：将具有8 mm孔径的Transwell小室放入24孔板中检测细胞的迁移能力。将200 μL细胞悬浮液(1 000个细胞)悬浮于不含胎牛血清的DMEM培养基中，然后加入上室中。 随后将500 μL含有10%胎牛血清的DMEM培养基加入下室中。24 h后，用磷酸盐缓冲液冲洗并用结晶紫染色，计算迁移细胞数量。细胞侵袭实验：实验前将60 μL基底胶(50 μg/mL)加到上室板表面，孵育2 h,其余步骤同细胞迁移实验。实验重复3 次。

1.3.6Western blot检测细胞中PCNA、E-cadherin、N-cadherin、AKT和p-AKT蛋白表达水平 检测步骤同1.3.3，不同的是在脱脂乳中封闭后，加入1∶1 000稀释的一抗PCNA、E-cadherin、N-cadherin、AKT、p-AKT和GAPDH。实验重复3次。

2 结 果

2.1转染si-OTUB2的胃癌细胞中OTUB2的表达情况 与空白对照组和si-NC组比较，si-OTUB2组OTUB2 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。见图1和表1。

注：1为空白对照组；2为si-NC组；3为si-OTUB2组。图1 Western blot检测3组细胞中OTUB2蛋白的表达情况

表1 3组细胞中OTUB2 mRNA、蛋白表达水平比较

2.2转染si-OTUB2的胃癌细胞增殖能力的变化 与空白对照组和si-NC组比较，si-OTUB2组细胞增殖能力减弱(P<0.05)。见图2。

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与si-NC组比较，#P<0.05。图2 3组细胞的生长曲线

2.3转染si-OTUB2的胃癌MGC-803细胞迁移和侵袭能力的变化 与空白对照组和si-NC组比较，si-OTUB2组细胞迁移数和侵袭数均减少(P<0.05)。见图3和表2。

图3 3组细胞迁移和侵袭情况

表2 3组细胞迁移数和侵袭数比较个)

2.4转染si-OTUB2的胃癌细胞中PCNA、E-cadherin、N-cadherin、AKT和p-AKT蛋白表达情况 与空白对照组和si-NC组比较，si-OTUB2组细胞中PCNA、N-cadherin和p-AKT蛋白表达水平降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.05)。见图4和表3。

注：1为空白对照组；2为si-NC组；3为si-OTUB2组。图4 3组细胞中PCNA、E-cadherin、N-cadherin、p-AKT和AKT蛋白的表达情况

表3 3组细胞中PCNA、E-cadherin、N-cadherin、p-AKT和AKT蛋白表达水平比较

3 讨 论

OTUB2在调控DNA修复通路、病毒触发信号、胰腺细胞活性和肿瘤进展等方面发挥着重要作用。其中，OTUB2决定DNA修复途径的选择，在DNA双链断裂反应的早期调节环指蛋白8(RNF8)介导的致死因子恶性脑瘤样蛋白1抗体(L3MBTL1)泛素化[7]。LI等[5]研究发现，OTUB2可通过直接介导肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)3和TRAF6(TRAF3和TRAF6是NF-κB所需的两种E3泛素连接酶)的去泛素化来抑制病毒引发的Ⅰ型干扰素诱导。此外，OTUB2在肿瘤进展中也发挥了重要作用。MA等[11]的研究表明，OTUB2可以通过NF-κB信号通路促进甲状腺癌细胞的增殖和侵袭。ZHANG等[9]发现，OTUB2通过激活不依赖于Hippo的Yes相关蛋白(YAP)和具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ)，促进乳腺癌的体内转移。LI等[10]的研究显示，OTUB2通过AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路稳定U2小核RNA辅助因子2(U2AF2)，促进非小细胞肺癌的瓦尔堡效应，促进肿瘤发生和转移。本研究发现，OTUB2在胃癌中发挥癌基因的作用，敲减OTUB2可以显著抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

PCNA是一种重要的真核复制辅助因子，在DNA复制和修复、细胞周期调控和细胞凋亡等方面发挥着重要作用，与细胞增殖、DNA合成、肿瘤细胞的生长密切相关，是反映细胞增殖活性的重要指标[12-14]。E-cadherin和N-cadherin是参与上皮间质转化(EMT)的相关蛋白，分别是上皮细胞标志物和间质细胞标志物[15]。肿瘤转移是一个多步骤的细胞生物学过程，包括一个关键事件EMT，EMT通过促进上皮细胞去极性，减少上皮细胞标志物的表达，诱导间质细胞标志物的表达，从而促使良性肿瘤发展为恶性转移性肿瘤[16]。本研究结果显示，下调OTUB2的表达后，胃癌细胞中PCNA和N-cadherin蛋白的表达水平均明显降低，E-cadherin蛋白的表达水平升高，进一步验证了下调OTUB2可以抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的结论。

PI3K/AKT通路的改变广泛存在于包括胃癌在内的多种肿瘤中，对肿瘤的发生和发展起着至关重要的作用，其中AKT在被PI3K磷酸化后激活，可促进肿瘤的进展[17-18]。此外，PI3K/AKT通路参与细胞增殖、凋亡、转移和EMT等多种生物学过程[19-20]。本研究在胃癌细胞中敲减OTUB2基因，从而显著抑制了PI3K/AKT信号通路中p-AKT的表达，说明下调OTUB2的表达可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路活化来抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

综上所述，在胃癌细胞中，下调OTUB2的表达能显著抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力，其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。OTUB2有望成为胃癌的潜在预后评估指标和治疗靶点。