TNFRSF10B在直肠癌中的表达及临床意义*

王明辉，张朝永，刘越军，张 健，张四新

1.河北省唐山市中医医院普外科，河北唐山 063000；2.中国人民解放军陆军第82集团军医院普外科，河北保定 071000

近年来，直肠癌的发病率逐年上升，患病人群越来越年轻化，成为仅次于肺癌的致命恶性肿瘤[1-2]。调查表明，直肠癌与人群的饮食、生活方式和基因遗传性等有关[3-4]，但其具体发病机制尚不明确。从分子水平研究影响直肠癌发生、发展的相关因子，寻找新的治疗靶点有利于直肠癌的防治。肿瘤坏死因子受体超家族成员(TNFRSF)10B属于Ⅰ型跨膜蛋白，是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的受体，参与多种肿瘤细胞的凋亡过程[5]。有研究报道，TNFRSF10可以激活肿瘤细胞中TRAIL凋亡途径，促进肿瘤细胞凋亡[6]。目前，关于TNFRSF10B的表达与直肠癌关系的研究较少，本研究采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和免疫组织化学染色法检测TNFRSF10B在直肠癌中的表达水平，分析其与患者临床病理特征和预后的关系，以期为直肠癌的治疗及预后评估提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2013年9月至2017年7月在唐山市中医医院进行手术治疗的直肠癌患者87例为研究对象，其中男50例，女37例；平均年龄(54.65±3.10)岁；临床分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期22例，Ⅲ期20例，Ⅳ期25例；肿瘤分化程度：低分化30例，中、高分化57例；有淋巴结转移43例，无淋巴结转移44例；有远处转移45例，无远处转移42例。纳入标准：(1)病理检查确诊为原发性直肠癌；(2)临床及随访资料完整；(3)术前未进行放、化疗。排除标准：(1)合并心、肾、肝等重要器官功能障碍；(2)合并精神疾病；(3)合并其他部位肿瘤。本研究获得唐山市中医医院医学伦理委员会审查批准，患者均签署知情同意书。

1.2仪器与试剂 Trizol试剂(批号：TR118-100)购自上海素尔生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix反转录试剂盒(批号：RR047A)购自日本Takara公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix RT-qPCR试剂盒(批号：Q111-02)购自南京诺唯赞生物科技有限公司；免疫组织化学染色法检测试剂盒(批号：QN2715)、羊抗兔IgG二抗(批号：QN2732-PWV)均购自北京百奥莱博科技有限公司；柠檬酸抗原修复液(批号：C1031)、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(批号：DA1010)购自北京索莱宝科技有限公司；TNFRSF10B兔抗人单克隆抗体(批号：BW5737)购自美国Santa公司；RT-qPCR仪(型号：SLAN-96P)购自上海宏石医疗科技有限公司；光学显微镜(型号：DM6M LIBS)购自德国徕卡公司；RT-qPCR所需引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1RT-qPCR检测直肠癌组织和癌旁组织中TNFRSF10B mRNA的表达 取研究对象的直肠癌组织及癌旁组织标本，按照Trizol试剂盒说明书，提取组织RNA，注意组织研磨时应在冰盒上快速进行，提取后检测其浓度，用PrimeScriptTMRT Master Mix反转录试剂盒进行反转录。配制RT-qPCR反应体系20 μL，每个标本重复检测3次，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，PCR反应条件：预变性95 ℃ 30 s，40个循环，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，延伸70 ℃ 10 s。TNFRSF10B引物序列：上游引物5′-CGGGCAGATCACTACACCC-3′，下游引物5′-AGTTCCCTTCTGACAGGTACTG-3′；GAPDH引物序列：上游引物5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游引物5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。反应结束后，TNFRSF10B相对表达水平用2-ΔΔCt计算。

1.3.2免疫组织化学染色法检测直肠癌组织和癌旁组织中TNFRSF10B蛋白的表达 将直肠癌组织及癌旁组织固定、脱水、石蜡包埋后连续切片，切片厚度约5 μm，免疫组织化学染色采用两步法，加兔抗人TNFRSF10B一抗(1∶150)，二甲苯脱蜡、水化，置于柠檬酸修复液中，高压修复抗原，孵育一抗、二抗，DAB显色，苏木素复染，温水返蓝，脱水、中性树脂进行封片，观察。TNFRSF10B染色结果从染色细胞百分比和染色强度两方面进行综合判断，(1)根据染色强度记分：无色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别记为0、1、2、3分；(2)根据阳性细胞百分比记分：<5%、5%～25%、>25%～50%、>50%～75%、>75%分别记为0、1、2、3、4分。染色强度和阳性细胞百分比记分相乘的值≤3分为低表达，>3分为高表达[7]。

1.3.3随访 术后对直肠癌患者均进行为期3年的随访，随访方式为门诊复查和电话随访，每3个月随访1次，如患者在随访期内死亡则以死亡日期作为随访截止日期。

2 结 果

2.1TNFRSF10B mRNA在癌旁组织和直肠癌组织中的表达水平比较 癌旁组织中TNFRSF10B mRNA的表达水平(1.30±0.12)明显低于直肠癌组织中TNFRSF10B mRNA的表达水平(2.62±0.15)，差异有统计学意义(t=64.094，P<0.05)。

2.2TNFRSF10B蛋白在癌旁组织和直肠癌组织中的高表达率比较 癌旁组织中TNFRSF10B蛋白的高表达率为13.79%，明显低于直肠癌组织中TNFRSF10B蛋白的高表达率(54.02%)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表1。

注：A为TNFRSF10B蛋白在癌旁组织中的表达；B为TNFRSF10B蛋白在直肠癌组织中的表达。图1 TNFRSF10B蛋白在癌旁组织和直肠癌组织中的表达情况(×400)

表1 TNFRSF10B蛋白在直肠癌组织及癌旁组织中的表达情况[n(%)]

2.3TNFRSF10B蛋白表达与直肠癌患者临床病理特征的关系 TNFRSF10B蛋白表达与直肠癌患者临床分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移有关(P<0.05)，与患者性别、年龄无关(P>0.05)。见表2。

表2 TNFRSF10B蛋白表达与直肠癌患者临床病理特征的关系(n)

2.4TNFRSF10B蛋白表达对直肠癌患者生存情况的影响 TNFRSF10B蛋白高表达的直肠癌患者3年生存率为57.45%(27/47)，低于TNFRSF10B蛋白低表达直肠癌患者的3年生存率[80.00%(32/40)]，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5预后影响因素分析 单因素分析结果显示，TNFRSF10B蛋白表达情况、临床分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移是直肠癌患者预后的影响因素(P<0.05)。多因素分析结果显示，TNFRSF10B蛋白高表达、临床分期Ⅲ+Ⅳ期、淋巴结转移是影响直肠癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响直肠癌患者预后的危险因素分析

3 讨 论

直肠癌是发病率和病死率较高的恶性肿瘤之一，目前，早期直肠癌的治疗多以手术为主，中晚期直肠癌多采用放疗和化疗，然而治疗后易复发，严重影响着患者的身体健康和生命安全[8-9]。随着生物科学技术的发展，从分子水平寻找直肠癌患者的预后预测指标已成为研究的热点。TNFRSF有多种生物学功能，在炎性反应、肿瘤、人体免疫等方面发挥着重要作用，TNFRSF与其受体结合后可以激活炎性反应，促进炎症信号传递，与机体炎症免疫相关[10-11]。韩翰等[12]研究发现，TNFRSF10B的表达影响乳腺癌细胞的自噬作用。大量研究表明，激活TRAIL及其受体TNFRSF10B可有效促进胃癌、宫颈癌、胰腺癌等癌细胞的凋亡[13-15]。TNFRSF10B在多种肿瘤疾病中发挥着重要作用，但关于TNFRSF10B在直肠癌中的研究报道较少，因此研究其表达与直肠癌发生、发展的关系具有一定的必要性。本研究发现，TNFRSF10B mRNA及蛋白在直肠癌组织中高表达，与部分研究发现的宫颈癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌中TNFRSF10B高表达的结果一致[12-15]，提示TNFRSF10B高表达与直肠癌发生有关，其高表达可能与机体在肿瘤发生时的主动抗肿瘤自卫机制有关。

研究发现，TNFRSF10B在膀胱癌组织中高表达，褪黑素能通过影响TNFRSF10B的表达水平，从而促进膀胱癌细胞凋亡[16]。RASHEDUZZAMAN等[17]研究表明，非小细胞肺癌细胞中TNFRSF10B呈高表达，替米沙坦可以增强TRAIL的敏感性，促进肿瘤细胞调亡。ROMAGUERA等[18]研究发现，TNFRSF10B在淋巴瘤患者中高表达，且参与淋巴瘤的发生、发展过程。以上研究提示TNFRSF10B在肿瘤细胞凋亡过程中发挥重要作用。肿瘤患者的预后与肿瘤细胞增殖、凋亡等密切相关。本研究结果显示，TNFRSF10B蛋白在直肠癌组织中的表达与临床分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移有关，提示TNFRSF10B的表达可能参与直肠癌的发生、发展过程，然而具体机制有待进一步研究。本研究中，TNFRSF10B蛋白低表达的直肠癌患者3年生存率高于TNFRSF10B蛋白高表达的直肠癌患者，进一步行多因素Cox回归分析结果显示，TNFRSF10B蛋白高表达、临床分期Ⅲ+Ⅳ期、淋巴结转移是影响直肠癌患者预后的独立危险因素，提示应加强对TNFRSF10B高表达、临床分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移的直肠癌患者的随访，关注其病情变化，并及时给予治疗，从而改善患者预后。

综上所述，TNFRSF10B在直肠癌组织中高表达，与直肠癌的发生、发展相关，对直肠癌患者预后评估有一定的指导意义。