无创产前检测适用人群的探讨及其临床应用评价

侯 伟，周红辉，谢潇潇，李江华，姜淑芳，高志英，游艳琴

1 解放军医学院，北京 100853；2 解放军总医院第一医学中心 妇产科，北京 100853

基于胎儿游离DNA(cell free DNA，cf-DNA)检测的无创产前筛查(noninvasive prenatal test，NIPT)用于检测胎儿常见的非整倍体及部分性染色体异常，敏感度：21-三体为0.994(0.983～0.998)，18-三体为0.977(0.952～0.989)，13-三体为0.906(0.823～0.958)；特异性均达到0.999以上，是目前最准确的产前筛查方法[1]。母体外周血中的胎儿cf-DNA主要来源于胎盘滋养层细胞，其遗传成分并不总是与胎儿一致，因此NIPT无法替代侵入性产前诊断(羊水穿刺术或绒毛膜穿刺术)[2]。目前NIPT的适用人群为血清学筛查临界风险、有侵入性产前诊断禁忌者以及错过血清学筛查最佳时间者，高龄孕妇(预产期年龄 ≥ 35岁)为NIPT的慎用人群[3]。同时高龄也是侵入性产前诊断的指征，因此临床上建议高龄孕妇可直接行侵入性产前诊断[4]。研究认为35～38岁孕妇的胎儿非整倍体发生率并无明显上升，孕妇35岁时孕中期胎儿21-三体的患病率为4.0‰，38岁时为8.7‰，而42岁时为24.1‰；18-三体和13-三体的发病率在38岁后也明显升高[5]。有学者因此提出，在NIPT日趋成熟的情况下，部分风险相对较低的高龄孕妇可行NIPT筛查，即37岁前可先行NIPT，筛查阳性者行侵入性产前诊断验证，阴性者不再行产前诊断[6]。以往研究证实NIPT在高危孕妇中有着很高的敏感度和特异性[7]。本研究对接受侵入性产前诊断的孕妇进行NIPT，比较不同产前诊断指征与胎儿染色体异常的相关性，探讨扩展NIPT的适用人群及临床应用价值。

对象和方法

1 对象 选取2018年1月16日- 2020年6月30日，在解放军总医院第一医学中心就诊的孕妇。纳入标准：1)年龄 ≥ 18岁；2)单胎妊娠；3)在解放军总医院第一医学中心行侵入性产前诊断，侵入性产前诊断的临床指征主要有预产期年龄 ≥35岁、血清学筛查高风险或灰区、NIPT结果异常、胎儿超声结构异常或软指标异常、不良妊娠史或遗传学家族病史(自身为患者或携带者、生育过遗传病患儿或家族中有遗传病患者)；4)经过咨询并签署知情同意书。排除标准：1)妊娠合并恶性肿瘤；2) 1年内接受过异体输血、移植手术、异体细胞治疗。本研究获得解放军总医院医学伦理委员会批准。

2 检测方法 1) NIPT：本研究入组孕妇均行NIPT，在侵入性产前诊断前两周内进行。每名入组孕妇采集8 mL外周血于cfDNA采血管 (Streck,USA)，分离血浆后使用DNeasy Blood Kit (Qiagen)提取基DNA，基因组DNA打断成小片段 (Covaris，S220，USA)，并使用KAPA Hyper Prep Kit (KAPA，KK8504，USA)构建文库。高通量测序在Nextseq CN500平台(Illumina，San Diego，CA)进行，以检测染色体非整倍体的情况。NIPT的结果表示为胎儿染色体异常高风险或低风险；若胎儿游离DNA浓度小于4%，NIPT无结果(no call)。2) 侵入性产前诊断：获得的羊水细胞或绒毛膜细胞行核型分析、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)或染色体微阵列分析(chromosome microarray analysis，CMA)。

3 危险因素分析及计算公式 采用多因素logistic回归分析，比较不同产前诊断指征与胎儿染色体异常的关系。NIPT的筛查方案：低风险者不再行侵入性产前诊断，高风险或无结果需行进一步产前诊断。当不同高危因素的孕妇应用该NIPT筛查方案后，计算侵入性产前诊断的需求量、异常检出率及NIPT的阴性预测值。计算公式如下：

侵入性产前诊断的需求量=入组孕妇总数-NIPT低风险数断，高风险或无结果需行进一步产前诊断。当不同高危因素的孕妇应用该NIPT筛查方案后，计算侵入性产前诊断的需求量、异常检出率及NIPT的阴性预测值。计算公式如下：

产前诊断的异常检出量=胎儿异常总数-NIPT为低风险的胎儿异常数断，高风险或无结果需行进一步产前诊断。当不同高危因素的孕妇应用该NIPT筛查方案后，计算侵入性产前诊断的需求量、异常检出率及NIPT的阴性预测值。计算公式如下：

产前诊断的阳性率=产前诊断的异常检出量/产前诊断的需求量

NIPT的阴性预测值=(NIPT低风险数-NIPT为低风险的胎儿异常数)/NIPT低风险数

4 统计学方法 统计分析使用SPSS22.0软件进行。计量资料以表示，计数资料以例数(百分比)表示，多因素分析采用logistic回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 孕妇一般情况及产前诊断信息 总计有1 261例孕妇纳入本研究，平均年龄(34.65±5.02)岁，行产前诊断时的平均孕周为(20.18±1.73)周，侵入性产前诊断的临床指征及检测项目见表1。

表1 1 261例孕妇的临床指征及产前诊断Tab.1 Clinical indications and methods of prenatal diagnosis in 1 261 pregnant women

2 侵入性产前诊断与NIPT结果比较 侵入性产前诊断检出胎儿染色体异常87例，异常检出率为6.90%，包括21-三体35例，18-三体6例，13-三体1例，性染色体非整倍体12例，胎儿嵌合体9例，微缺失重复22例，杂合性缺失1例，单亲二倍体1例。NIPT高风险或无结果82例，低风险 1179例。对于上述胎儿染色体异常，NIPT整体的特异性为97.61%(1 146/1 174)，阴性预测值为97.20%(1 146/1 179)，诊断符合率为95.16%(1 200/1 261)(表2)。NIPT低风险但产前诊断证实胎儿异常33例，其中32例来源于NIPT检测范围之外的染色体异常，包括胎儿微缺失重复22例、胎儿嵌合体7例、杂合性缺失1例、单亲二倍体1例、等臂双着丝粒Y染色体1例(表3)。

表2 1 261例孕妇的NIPT及产前诊断结果(n, %)Tab.2 Results of NIPT and prenatal diagnosis of 1 261 pregnant women (n, %)

表3 产前诊断结果为异常而NIPT为低风险的33例孕妇信息Tab.3 Inconsistency between NIPT and invasive prenatal diagnosis in 33 cases

3 胎儿染色体异常的相关性分析 以胎儿是否存在染色体异常作为因变量，在接受侵入性产前诊断的孕妇中比较不同产前诊断指征与胎儿染色体异常的相关性。多因素logistic全模回归分析显示：在这一人群中，高龄(OR=0.470，P=0.010)和超声异常(OR=2.939，P＜0.001)与胎儿染色体异常的相关性有统计学意义，而血清学筛查异常(OR=0.075)和不良孕产史及家族史(OR=0.492)无统计学意义(表4)。临床意义：在接受侵入性产前诊断的孕妇中，单纯高龄孕妇的胎儿染色体异常风险低于这一人群的平均风险，而超声异常的孕妇高于这一人群的平均风险。

表4 胎儿染色体异常的多因素logistic回归分析(n, %)Tab.4 Multivariate logistic regression analysis of factors related to fetal chromosome abnormalities (n, %)

4 单纯高龄孕妇应用NIPT对产前诊断的影响 1 261例孕妇的胎儿异常检出率为6.90%。本研究中高龄孕妇占55.51%(700/1 261)，其中高龄为唯一危险因素的孕妇占44.09%(556/1 261)。38岁以下的单纯高龄孕妇应用NIPT时，产前诊断的需求数量减少16.34%(217/1 261)，产前诊断的阳性率为7.87%。42岁以下的单纯高龄孕妇应用NIPT时，产前诊断的需求数量减少35.77%(472/1 261)，产前诊断的阳性率为10.00%。所有单纯高龄孕妇应用NIPT时，产前诊断需求量下降42.19%(532/1 261)，产前诊断阳性率达11.11%，阴性预测值为98.92%(图1)。单纯高龄孕妇中共发现6例胎儿染色体异常而NIPT为低风险，其中1例为性染色体嵌合 [X0(26%)/XY(74%)]，1例为10号染色体单亲二倍体，4例为微缺失重复(缺失/重复片段大小1.2～2.4 Mb)，均在NIPT检测范围外。

图1 改变NIPT的年龄限制对产前诊断的需求量及阳性率的影响Fig.1 Effects of changing age limits for NIPT on demand for prenatal diagnosis and positive rate

5 其他单一高危因素的孕妇应用NIPT对产前诊断的影响 唯一危险因素为超声异常的孕妇占6.66%(84/1 281)，应用NIPT可减少6.58%(83/1 261)的产前诊断，阴性预测值91.57%(76/83)；血清学筛查异常为唯一危险因素的孕妇占19.19%(242/1 261)，应用NIPT可减少18.87%(238/1 261)的产前诊断，阴性预测值98.32%(234/238)；不良孕史或家族史为唯一危险因素的孕妇占9.60%(121/1 261)，应用NIPT可减少9.60%(121/1 261)的产前诊断，阴性预测值97.52%(118/121)。不同危险因素的孕妇应用NIPT筛查后产前诊断的阳性率：血清学筛查异常为8.11%，超声异常为6.79%，不良孕史或家族史为7.37%(表5)。

表5 单一高危因素孕妇应用NIPT对产前诊断的影响Tab.5 Effect of NIPT on need of prenatal diagnosis in pregnant women with a single risk factor

讨 论

随着我国二胎政策的开放以及生育观念的改变，产前诊断的服务量逐年提高，并且2013年以后高龄成为产前诊断的最主要指征[8]。与此同时，NIPT在近十年发展迅速，2020年美国妇产科医师学会提出：无论年龄或其他风险因素如何，均建议对所有孕妇进行无创产前检测[9]。NIPT属于一项筛查技术而非诊断技术，其结果存在一定的不确定性。NIPT假阳性的原因包括局限性胎盘嵌合体、孕妇本身为染色体非整倍体、母源性的拷贝数变异、母源性恶性肿瘤、双胎之一胎死宫内等；假阴性的原因包括胎儿浓度较低、胎盘低比例嵌合、胎儿嵌合但胎盘正常等[10]。目前各专业结构推荐的NIPT检测范围包括211813号染色体以及部分性染色体的异常，尚不推荐将检测范围扩展至微缺失重复以及其他染色体异常[11-12]。因此，能否通过扩展NIPT适用人群来减少产前诊断值得讨论。

本研究主要探讨扩展NIPT的适用人群及应用评价。胎儿非整倍体风险随孕妇年龄增大而升高，35岁孕妇胎儿非整倍体风险与产前诊断导致的流产风险大致相当(约1/200)，据此大多数国家的医疗机构对35岁及以上的孕妇提供产前诊断[13]。孕妇年龄作为筛查的敏感度和阳性预测值低，高龄作为产前诊断指征受到越来越多的质疑[6]。本研究中高龄与胎儿染色体异常的相关性低于其他产前诊断指征，因此在高危孕妇中优先选择高龄孕妇应用NIPT。在单纯高龄孕妇中，依据年龄逐步扩展NIPT的应用范围，产前诊断的需求量下降达42.19%，产前诊断发现胎儿异常比例由6.90%升至11.11%，提高了产前诊断的效率，同时阴性预测值达98.92%。因此单纯高龄孕妇可行NIPT，根据筛查结果决定是否行侵入性产前诊断。

超声异常包括胎儿结构异常和软指标异常，这些异常很有可能与某个遗传综合征或遗传缺陷疾病相关。导致超声异常的遗传学因素很多，相当一部分超出了NIPT的检测范围，如染色体拷贝数异常(copy number variation，CNV)、胎儿嵌合体等，仅行NIPT无法除外这些遗传学异常。Wapner等[14]研究发现超声提示结构异常但核型分析正常的胎儿，可额外检出6.7%的CNV，高于高龄孕妇(1.6%)，提示胎儿结构异常与CNV之间存在相关性[14]。本研究中，当孕妇合并超声异常时NIPT漏诊风险明显升高，NIPT阴性预测值仅为91.57%。因此对于超声提示胎儿结构异常的孕妇，不建议行NIPT筛查，仍需侵入性产前诊断。

除了扩展适用人群之外，扩展NIPT的检测范围同样意义重大。理论上基于全基因组测序的NIPT可以发现胎儿的染色体拷贝数异常，即NIPT-plus。NIPT通常采用低深度测序，增加测序的深度可以提高检出胎儿CNV的能力，同时减少假阳性率[15]。并不是所有的CNV都适合进行筛查，需要考虑到CNV的大小、外显率、表型、发病率等因素。CNV越小，需要的测序深度及成本越高；CNV越大，包含的基因越多，致病的可能性越高。目前已有商业化的NIPT涵盖表型明确、外显率高、发病率相对较高的CNV，如DiGeorge Syndrome (DGS)、1p36 Deletion、16p12.2-p11.2 Syndrome、Angelman/Prader-Willi Syndrome、Cridu-chat Syndrome等[16]。与非整倍体不同，胎儿CNV的发病率与孕妇年龄无关[17]。本研究共检出22例微缺失重复，其中5例在NIPT中有相应发现，敏感度为27.3%(6/22)。还有部分NIPT发现的微缺失重复缺乏CMA检测及临床验证，本研究尚无法计算NIPT对于微缺失重复的阳性预测值，待完善新生儿随访作为临床验证，可计算NIPT检出胎儿微缺失重复的阳性预测值及特异度。目前还需要大规模的队列研究证实NIPT-plus效能，作为临床常规应用的方案尚不成熟[18-19]。

综上所述，在NIPT应用日趋完善的今天，高龄孕妇在排除其他产前诊断指征之后可以选择NIPT进行筛查，出现阳性结果时再行产前诊断，从而避免有创操作带来的流产风险。将NIPT的适用人群扩展至单纯高龄孕妇可以显著减少产前诊断数量，并提高产前诊断的效率。对于合并超声异常、血清学筛查异常、不良孕史或遗传学家族史的孕妇，选择NIPT将承担更大的漏诊风险，并且漏诊风险主要来源NIPT检测范围之外的染色体异常，如胎儿嵌合体、微缺失重复等。因此要严格把握NIPT适用指征，合并高龄以外产前诊断指征的孕妇仍需行侵入性产前诊断。