不同产地及种植年限巴戟天中6种寡糖类成分的定量分析

2021-07-21 02:28朱露林易晓薇徐金龙刘考铧刘梦琴秦路平张巧艳
中草药 2021年14期
关键词:巴戟天糖类寡糖

朱露林,沈 ,易晓薇,徐金龙,刘考铧,刘梦琴,张 奇,秦路平*,张巧艳*

1.浙江中医药大学药学院,浙江 杭州 310053

2.中国人民解放军联勤保障部队第九六九医院,内蒙古 呼和浩特 010051

巴戟天为茜草科(Rubiaceae)植物巴戟天Morinda officinalisHow.肉质干燥根,主产于广东、广西、福建、海南等地,并收载于历版《中国药典》。巴戟天入肝、肾经,味甘、辛,性温;具有补肝肾、通筋活络、强筋骨、祛风湿的功能,常用于治疗阳痿遗精、宫冷不孕、月经不调、少腹冷痛、风湿痹痛和筋骨痿软等病症[1-2]。研究表明巴戟天主要含有多糖、寡糖、环烯醚萜苷和蒽醌等化学成分,具有温肾壮阳、抗炎、镇痛、抗骨质疏松、抗抑郁、免疫调节和抗氧化等多种生物活性[3-7]。巴戟天含糖量较高,包括单糖、寡糖和多糖,《中国药典》2020年版以寡糖类成分耐斯糖的含量作为评价巴戟天药材的质量标准[1]。研究发现寡糖类成分具有抗抑郁、抗焦虑、抗衰老、抗炎、促进精子生成和抗心肌缺血再灌注等作用[2,8-11]。目前对寡糖类成分的测定,缺少以活性寡糖类成分为评价指标研究不同产地和生长年限的巴戟天药材中蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖含量变化情况。本研究以6种寡糖为指标成分,采用HPLC-ELSD的方法进行含量测定,对不同产地及种植年限巴戟天药材进行综合评价,以期为巴戟天寡糖的质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

Agilent 1260高校液相色谱仪(美国Agilent公司);ELSD1290蒸发光散射检测器(美国Agilent公司)。

蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖(蔗果四糖)、1F-果呋喃糖基耐斯糖(蔗果五糖)、蔗果六糖、蔗果七糖对照品均购于上海源叶生物科技有限公司,质量分数均大于98%;乙腈为色谱纯(泰坦科技股份有限公司),水为超纯水,其余均为分析纯。

21批巴戟天样品于2017年4月至2019年10月采自福建、广东和广西等种植地,及2批商品药材,编号S1~S23,见表1,经浙江中医药大学张巧艳教授鉴定为巴戟天Morinda officinalisHow.的地下部分。

表1 巴戟天药材来源Table 1 Sources of Morinda officinalis

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

精密称取蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖对照品适量,初始流动相配制成质量浓度分别为0.850、0.604、0.732、0.366、0.396、0.754 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备

精密称取巴戟天粉末(过3号筛)约3 g,精密称定,置具塞锥形中,精密加入5%乙醇50 mL,称定质量,回流30 min,放置室温后,5%乙醇补足质量,摇匀,滤过。

2.3 色谱条件

色谱柱为Shodex Asahipak NH2柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),检测器为ELSD蒸发光散射检测器,流动相为乙腈(A)-0.1%乙酸水溶液(B),梯度洗脱:0~35 min,70%~67% A。体积流量1.0 mL/min;进样量6 μL,漂移管温度80 ℃,雾化管温度40 ℃,平滑时间5.0 s,增益值为1.0,氮气体积流量1.6 mL/min,柱温28 ℃。6种寡糖对照品和样品色谱图见图1,分离度均>1.5。

图1 巴戟天寡糖混合对照品 (A) 和供试品溶液 (B) 的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of Morinda officinalis oligosaccharides mixed reference substances (A) and sample(B)

2.4 线性关系考察

精密量取“2.1”项下混合对照品溶液,用有机微孔滤膜(0.22 μm)滤过,分别进样1、2、4、8、10、12、16、20、32 μL,按“2.3”项下色谱条件测定,以质量为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,得线性回归方程,结果见表2。

表2 巴戟天6种寡糖类成分的线性关系Table 2 Linear relationships of oligosaccharides of Morinda officinalis

2.5 精密度试验

精密称取样品(S21),按照“2.2”项下方法制备,“2.3”项下色谱条件连续进样6次,记录峰面积,结果蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖的峰面积RSD值分别为0.51%、0.06%、1.01%、0.28%、0.95%、0.09%,表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性试验

精密称取样品(S21)6份,按照“2.2”项下方法制备,“2.3”项下色谱条件测定。结果蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖的质量分数RSD值分别为2.94%、2.93%、1.59%、2.08%、1.16%、1.93%,表明该方法的重复性良好。

2.7 稳定性试验

精密称取样品(S21),按照“2.2”项下方法制备,“2.3”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24、48 h测定。结果蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖的峰面积RSD值分别为1.48%、1.04%、0.89%、0.81%、0.70%、0.69%,表明样品在48 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已测定样品(S21)约0.02 g,共6份,分别精密加入蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖对照品适量,按照“2.2”项下方法制备,“2.3”项下色谱条件测定,记录峰面积,计算回收率。结果表明,寡糖各成分的加样回收率良好。蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖的平均加样回收率分别为99.22%、101.12%、98.71%、101.56%、100.37%、101.56%,RSD值分别为3.08%、0.85%、2.45%、2.56%、3.26%、3.11%。

2.9 样品测定

精密称取S1~S23批样品,按照“2.2”项下方法制备,取制备的供试品溶液1 mL,按“2.3”项下色谱条件测定。进行3次平行实验,记录峰面积,标曲计算各成分的含量,结果见表3。结果表明,福建栽培地区采收的样品中,随着种植年限的增加,寡糖的含量越来越低,寡糖的质量分数在(232.53±9.48)~(342.31±43.88)mg/g,蔗果六糖以6年生南靖巴戟天含量最高,蔗果七糖以5年生龙岩巴戟天含量最高。广东各栽培产地中寡糖含量在(111.92±6.52)~(394.68±19.14)mg/g,差异较大,其中蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖的含量以3年生高要巴戟天含量最高。而野生巴戟天和商品药材中寡糖各成分的含量均很低。

表3 巴戟天药材中6种寡糖类成分的测定结果 (±s , n=3)Table 3 Determination results of six oligosaccharides in Morinda officinalis (±s , n=3)

表3 巴戟天药材中6种寡糖类成分的测定结果 (±s , n=3)Table 3 Determination results of six oligosaccharides in Morinda officinalis (±s , n=3)

编号 质量分数/(μg·g-1)蔗糖 蔗果三糖 耐斯糖 蔗果五糖 蔗果六糖 蔗果七糖 总含量S1 32.99±0.88 20.57±1.31 49.03±2.38 63.30±3.41 59.38±3.36 80.87±4.36 306.13±12.97 S2 35.59±4.92 29.90±5.59 56.27±10.36 71.41±12.46 70.54±4.90 79.57±7.03 342.31±43.88 S3 29.30±8.22 15.03±3.04 42.13±9.35 58.21±12.21 56.82±11.29 79.89±10.33 281.36±53.91 S4 31.03±5.94 17.83±4.18 38.32±4.70 48.85±6.06 47.26±6.64 63.52±2.94 246.80±18.50 S5 32.93±1.26 15.04±0.44 36.61±0.37 49.63±1.00 47.83±1.02 64.10±2.05 246.15±4.51 S6 35.12±8.94 11.77±1.83 36.29±0.52 46.97±1.14 43.61±3.54 64.42±5.15 238.17±18.25 S7 20.71±4.88 10.75±1.09 38.02±1.41 50.85±2.57 48.32±3.49 63.87±4.45 232.53±9.48 S8 35.25±0.77 19.91±0.69 34.79±1.49 42.81±1.16 40.61±1.83 55.25±1.46 228.61±5.77 S9 63.74±2.26 37.01±1.91 67.95±3.57 80.72±4.42 69.82±3.40 75.44±4.15 394.68±19.14 S10 23.38±0.94 10.73±0.51 23.13±1.23 30.23±1.56 31.83±1.33 46.13±2.13 165.43±6.20 S11 34.93±1.21 15.61±0.78 39.76±2.23 51.61±2.93 48.47±2.74 62.04±3.68 252.42±12.27 S12 36.05±0.57 14.47±0.48 29.83±0.93 35.98±2.01 34.02±1.08 46.55±1.04 196.89±4.36 S13 23.96±0.38 23.76±0.67 34.45±1.00 43.90±0.95 43.37±0.56 58.57±1.55 228.01±4.77 S14 39.29±1.36 21.11±0.25 40.57±0.15 52.24±0.48 50.54±0.66 66.62±0.91 270.37±1.85 S15 13.74±1.47 13.35±0.82 27.52±1.42 35.67±1.12 35.27±0.79 47.40±1.71 172.96±4.66 S16 27.96±2.36 18.26±0.99 41.49±0.69 56.88±0.94 56.43±0.83 73.58±0.65 274.60±4.96 S17 27.75±1.43 20.04±0.52 34.94±0.54 45.30±0.27 45.67±0.89 61.18±2.12 234.89±2.67 S18 42.17±2.66 29.77±2.16 11.84±0.84 9.52±0.77 7.89±0.29 10.74±0.31 111.92±6.52 S19 30.53±0.52 14.61±0.43 33.99±1.24 45.31±2.45 44.49±1.44 62.62±3.86 231.56±8.73 S20 17.64±0.26 8.07±0.19 20.59±0.63 28.75±0.59 30.46±0.92 43.97±0.87 149.47±3.40 S21 15.06±0.92 9.81±0.83 20.55±0.67 26.84±0.80 27.03±0.37 38.41±1.11 137.69±3.63 S22 11.78±0.03 8.80±0.29 15.53±0.15 19.91±0.38 22.48±0.52 35.12±1.00 113.62±1.43 S23 12.30±0.25 6.17±0.07 16.84±0.58 23.81±0.92 24.52±0.45 38.01±0.92 121.65±2.43

3 讨论

药材中次生代谢产物的形成以及含量变化是一个复杂的动态过程,与生态环境、生长年限以及物候期有着紧密的关系[12]。本研究通过采集不同产地及不同种植年限、采收时间的19批巴戟天新鲜样品和2批野生巴戟天样品及2批商品药材进行含量测定研究,发现巴戟天肉质根中寡糖类成分的含量存在较大差异。

不同地区土壤、光照、降水、气候等环境因素不同,影响寡糖类成分在肉质根的积累过程,从而导致巴戟天药材的质量差异。巴戟天主产于福建、广东、广西等地,广东种植基地较多,且分布较广,这可能是导致寡糖类成分差异较大的原因;福建主要的种植基地漳州南靖和龙岩,种植规模均相对较小,属于农民散户的小面积栽培。目前,广西已无大面积巴戟天种植基地,多数为生长在深山环境中的野生品,自然环境中降水、光照和营养物质等生长条件不稳定,导致有效成分累积缓慢、含量偏低。除此之外,人工栽培巴戟天会于春季对枝叶进行修剪以减少了水分的蒸腾及有机物的分解,使得植物长势更好,有利于营养物质更多的积累。这可能是2批野生巴戟天药材寡糖含量较低的原因。

同一产地不同种植年限的巴戟天寡糖类成分含量之间也存在显著的差异。福建巴戟天样品结果显示,随着种植时间增长,寡糖增加呈先增后降的趋势,广东巴戟天寡糖含量也有此趋势。可能是巴戟天生长期光合作用使得单糖合成并累积,并在酶的催化作用下合成寡糖,使其含量逐渐升高;随着生长年限的增加,植物光合作用的速率下降,如气孔和非气孔限制(叶片衰老),使得单糖合成减少[13]。而耐斯糖等寡糖是在蔗糖的基础上逐渐增加一个果糖而成[14],可能是单糖逐渐与寡糖聚合,寡糖的上单糖的数量逐渐增加,最终聚合成多糖,这可能是导致后期巴戟天寡糖含量下降的原因。根据含量测定的结果提示,福建种植的巴戟天建议在6年左右采摘,广东种植的巴戟天建议3年左右采摘为宜。

新鲜采摘的不同产地及种植年限的巴戟天样品,除广东莫村6年生巴戟天外,其余样品耐斯糖的含量均高于2%,符合药典规定的巴戟天中耐斯糖含量不低于2%[1]。6年生莫村巴戟天耐斯糖含量低于2%,可能是由于聚合度较低的寡糖如3~5糖慢慢水解,使得耐斯糖水解脱去1分子果糖成为蔗果三糖,蔗果三糖再脱去1分子果糖成为蔗糖,进而导致蔗糖和果糖含量升高,耐斯糖的含量降低[15]。2批商品药材中耐斯糖的含量低于2%,这可能是商品药材在处理和储存过程中也会导致寡糖含量的损失,与文献[15]结果一致。

巴戟天抗抑郁的主要成分为耐斯糖,且药典规定其耐斯糖含量不得低于2%[1]。此次研究通过测定不同产地、不同年限巴戟天中6种寡糖含量,阐明了不同产地巴戟天中寡糖含量差异及其最佳采收时间。巴戟天从种植到采收总体周期较长,而选择在最佳采收时间采摘巴戟天可以更加充分地利用该资源,发挥更好的药效,显著提高巴戟天药材的质量,对巴戟天寡糖的质量控制及其临床应用提供保障。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

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