一测多评法同步测定钩藤饮片中3种黄烷类成分的含量

胡新华，陈玩珊，原文鹏

(深圳市人民医院<暨南大学第二临床医学院，南方科技大学第一附属医院>药学部，广东 深圳 518020)

钩藤来源于茜草科植物钩藤[Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil.]、大叶钩藤(UncariamacrophyllaWall.)、毛钩藤(UncariahirsutaHavil.)、华钩藤[Uncariasinensis(Oliv.)Havil.]或无柄果钩藤(UncariasessilifructusRoxb.)的干燥带钩茎枝。秋、冬二季采收，去叶，切段，晒干[1]。具有息风定惊、清热平肝之功效。常用于肝风内动、惊痫抽搐、高热惊厥、感冒夹惊、小儿惊啼、妊娠子痫、头痛眩晕。研究表明，钩藤中的生物碱类成分能够抑制外周血管收缩，使血管阻力降低，血压降低，同时有抗血小板聚集和抗血栓的作用，临床上用于降血压[2]。目前对该类成分的含量测定已多有报道。另一类黄烷类成分包括儿茶素、表儿茶素、原花青素B2等成分含量测定的报道则少有关注。因该类成分近年因广泛的生物活性[3-9]被更多关注，并且考虑到B型原花青素对照品的不易得和稳定性较差的问题，该类成分的含量测定最优选择为一测多评法(QAMS)。一测多评法[10]采用只测定药材或制剂中某个代表性成分(易得、价廉、有效、稳定)，同时又可计算其他待测成分的含量，可有效克服对照品短缺等问题，还能对药材或制剂进行多指标质量控制。对此，本文应用一测多评法实现对钩藤饮片的多指标质量控制，即应用其中一个对照品(儿茶素)建立该成分与其余待测成分(表儿茶素、原花青素B2)间的相对校正因子，对钩藤饮片中黄烷类成分的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 安捷伦 1260 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Mettler Toledo Ms 十万分之一电子天平(德国梅特勒公司)；KQ-500DE 超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；DLSB-5/20 低温冷却循环泵(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试剂试药 甲醇、乙腈，色谱纯；乙醇、石油醚(30～60 ℃)、乙酸乙酯为分析纯，水为双蒸水。

对照品：儿茶素(含量测定用，深圳健竹生物科技有限公司，批号:20170205，纯度 99.48%)；表儿茶素(含量测定用，深圳健竹生物科技有限公司，批号:20160930，纯度 98.83%)；原花青素 B2对照品(自制，纯度≥98.13%)。

药材饮片：钩藤饮片来自深圳市人民医院中药房，共 10 个批次，产地分别为广西、云南和湖南。

2 方法与结果

2.1 一测多评方法学考察

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：水(A)-甲醇(B)；采用梯度洗脱程序，流动相比例为：0～30 min，10%B→47%B；30～35 min，47%B→90%B。流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长230 nm。上述色谱条件下,各组分分离度良好。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取儿茶素对照品、表儿茶素对照品及原花青素B2对照品适量，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得儿茶素、表儿茶素及原花青素B2分别为0.68、0.62、0.65 mg·mL-1的对照品溶液，备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取钩藤细粉约10.00 g，加入100 mL乙醇超声提取30 min，过滤，滤液减压蒸干，加入100 mL蒸馏水超声分散，水溶液转移至250 mL的分液漏斗中，加入石油醚(30～60 ℃)50 mL，萃取，弃去石油醚层，水层继续加50 mL乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，减压蒸干，用甲醇少量多次将样品转移至5 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.4 线性和范围 精密吸取上述混合对照品溶液2、4、6、8、10 μL,进样分析,每个浓度进样2次,取平均值。以进样量对峰面积积分值进行回归,儿茶素、原花青素B2、表儿茶素的标准曲线见表1。

表1 各检测成分的回归方程、相关系数和线性范围

2.1.6 精密度试验 精密吸取儿茶素、原花青素B2、表儿茶素供试品溶液10 μL连续进样6次,以测得的峰面积响应值作为评价指标，得到3种成分的RSD分别为 1.2%、1.5%、1.9%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 分别取供试品 3、4、9，按照“2.1.3”项下方法操作，得到供试品溶液，分别于配制后的 0、2、4、6、8、12 和 24 h 取 10 μL进样测定峰面积,儿茶素、原花青素B2和表儿茶素在24 h内峰面积的RSD分别为1.1%、1.6%、1.4%。表明处理后的样品在24 h内稳定。

2.1.8 重复性试验 称取同一批钩藤样品2的药材粉末共 6 份，精密称定，按照“2.1.3”项下方法操作，得到供试品溶液，测定儿茶素、原花青素B2和表儿茶素的平均含量分别为0.018%、0.0041%和0.0085%；RSD分别为1.3%、0.7%、1.6%。

2.1.9 加样回收率试验 精密称取适量含量已知的钩藤粉末9份，精密称定，随机分为3组，每组按照药材含量80%、100%、120%的比例分别加入儿茶素、原花青素B2、表儿茶素对照品，加入甲醇补足至5 mL，按“2.1.3”项下制备供试品，测定，计算加样回收率，儿茶素、原花青素B2、表儿茶素的加样回收率分别为 99.8%、100.7%、100.3%，RSD分别为2.7%、2.2%、3.0%。

2.2 校正因子重现性考察

2.2.1 色谱柱及高效液相色谱仪考察 试验考察了Waters 2695-2996、Agilent 1260两种高效液相色谱系统，每种型号的仪器各一台,考察了Agilent Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Inertsil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)两种色谱柱。计算原花青素B2、表儿茶素对儿茶素的相对校正因子依次在0.600～0.724、0.694～0.769，其中不同仪器所得相对校正因子的RSD在1.2%～5.0%，同一仪器不同色谱柱所得相对校正因子的RSD在0.29%～4.9%。

2.2.2 待测组分色谱峰的定位 根据儿茶素的保留时间，计算原花青素B2和表儿茶素对于儿茶素的相对保留时间，可对其色谱峰进行定位，考察相对保留时间在不同品牌仪器和不同规格色谱柱中的重现性，其中原花青素B2对儿茶素的相对保留时间在1.102～1.124,表儿茶素的相对保留时间在2.195～2.306，RSD分别为0.66%、2.1%。

2.2.3 一测多评法与外标法结果比较 精密吸取不同批次饮片供试品溶液各 5 μL 进样并测定。采用外标法和一测多评法分别计算钩藤饮片中儿茶素、原花青素B2、表儿茶素的含量,结果见表2。

表2 外标法和一测多评(QAMS)法测定钩藤饮片中目标成分含量(mg·mL-1)

比较两种方法所得到的含量值,其中原花青素B2的相对误差在0.8%～2.6%,表儿茶素的相对误差在0%～5.0%，表明两种含量测定方法得到的含量值之间无显著性差异,一测多评法应用于钩藤饮片中3种成分的含量测定可行性较高。

3 讨论

3.1 提取溶剂考察 本试验考察了甲醇、乙醇和水作为提取溶剂进行提取,发现使用体积分数为95%乙醇对供试品进行超声提取，3种目标成分提取率较高,分离度较好。

3.2 检测波长选择 通过对儿茶素、原花青素B2和表儿茶素进行全波长扫描发现，3种成分紫外吸收十分相似，均在 230 nm 处有最大吸收，在 270 nm 处有肩峰，故选取 230 nm 为检测波长。

3.3 检测结论 从检测结果来看，3种成分中儿茶素含量最高，其次是表儿茶素，原花青素B2含量最低；从产地来看，云南产钩藤饮片中3种成分的含量较高。

3.4 一测多评方法建立的相关考察 本试验考察了常用不同厂家液相色谱仪器、不同类型色谱柱，结果表明，由于3种成分均为黄烷类成分，紫外吸收相近，相对校正因子的RSD值差异较小,因此利用一测多评的相对校正因子对其进行质量控制是合理可靠的。含量测定结果表明不同产地的钩藤饮片中3种黄烷类成分含量及比例差异较小，用QAMS计算值与外标法实测值之间没有显著性差异，说明建立的校正因子具有较好的可信度。

4 结论

钩藤中的生物碱类成分一直是该药材中研究的热点及主要的质控目标，但中药的药效往往是多成分多靶点共同作用的结果，因此关注除生物碱以外的多种活性成分也是中药质量控制的重要方向。本试验建立了钩藤饮片3种成分的一测多评法，同时检测儿茶素、原花青素B2和表儿茶素。原花青素B2类成分属于缩合鞣质类成分，高温和光照易分解,稳定性较差，因此该类成分的对照品制备有较高的难度和局限性，外标法对该类成分的测定中往往因对照品供应等问题，实施难度较高。考虑到原花青素B2稳定性差，纯化难度高，对照品不易得等实际问题，而儿茶素对照品廉价易得且在钩藤饮片中含量较高，因此本试验中选择儿茶素为内参，采用一测多评法可对钩藤饮片中的缩合鞣质以及其基本组成单元儿茶素和表儿茶素进行同时测定。

本试验旨在建立较为方便且实用的一测多评的方法对钩藤饮片的黄烷类成分进行测定，在建立方法的过程中选用了最接近临床和使用方便的药房饮片，共选取了 3 个产地，通过本试验建立的方法希望可以在将来钩藤药材的全产业链的质量控制和评估中发挥相应作用。