PKCβ1和MEK1/2在子宫内膜异位症组织及间质细胞中的表达及意义

商丽红，杨玉娥，王 芳，王文霞，哈春芳

子宫内膜异位症(EMs)是育龄期妇女常见的激素依赖性疾病，引起子宫内膜异位症的原因目前尚不清楚，月经血回流被认为是最有可能引起子宫内膜异位症的原因，其他原因包括遗传因素、免疫紊乱、雌激素失衡和手术等[1]。蛋白激酶Cβ1(Protein Kinase Cβ1，PKCβ1)是蛋白激酶家族中的一员，肿瘤学研究显示，PKCβ1参与了多种癌症的发生发展，并在细胞的增殖、侵袭、黏附等方面发挥重要作用[2]。丝裂原激活的蛋白激酶激酶1/2(MEK1/2)是MAPK信号通路的关键组成部分，该信号转导途径将细胞外信号传递到细胞核中，级联激活多种蛋白，包括Ras、Raf、MEK和ERK。作为MAPK/ERK信号中至关重要的蛋白，MEK1/2被其上游RAF激酶磷酸化并激活。因此，MEK1/2的激活导致MAPK信号通路与多样化的细胞过程有关，包括细胞增殖、分化、细胞存活和细胞凋亡[3]。本研究通过检测PKCβ1、MEK1/2在子宫内膜组织和原代子宫内膜间质细胞中的表达情况，分析两者与增殖侵袭相关蛋白的关系，进一步验证其在子宫内膜异位症中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 标本获取：收集2019年5月-2020年9月因卵巢子宫内膜异位症行腹腔镜手术，于术后或术后经病理科证实为Ems的患者60例，EMs在位内膜组与EMs异位内膜组各30例，同期因良性卵巢肿瘤行手术治疗的患者30例作为对照组(正常子宫内膜组)。本研究已经通过医学伦理委员会批准，患者均签署治疗知情同意书。

1.1.2 纳入标准：研究对象年龄25～35岁，手术前患者月经周期正常，近3个月均未接受过激素类药物治疗，无生殖道炎症及其他妇科疾病等。

1.2 主要试剂：PKCβ1抗体、MEK1/2抗体、MMP9抗体、PCNA抗体、DAB显色试剂盒、蛋白提取试剂盒、蛋白定量试剂盒。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组化法:组织标本由病理科证实为EMs后于10%甲醛溶液中浸泡过夜，4%甲醛固定，脱水、石蜡包埋，3～4 μm厚度连续切片，在70 ℃烤箱过夜;经过脱蜡，抗原修复，一抗孵育(PKCβ1、MEK1/2，4 ℃过夜)，二抗孵育2 h，DAB显色，酒精梯度脱水，二甲苯透明后用中性树胶封片，以PBS作为阴性对照，应用Image pro plus进行数据处理。

1.3.2 原代子宫内膜间质细胞培养：组织于手术时用刮勺刮取内膜，置于15 mL离心管中(含有配置好的培养基)，再置于冰盒中迅速送往实验室。用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗子宫内膜组织中的血液成分，用眼科剪将内膜剪成约1 mm3大小的组织块，加入胶原酶Ⅳ在37 ℃温箱中吹打消化2次，每次10 min，吸取上清液加入离心管，1∶1的比例加入含有血清的培养液终止消化，800 r/min离心，取上清加入60 mm培养皿中，显微镜下观察后置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

1.3.3 Western-blot检测各组蛋白表达情况：按照凯基全蛋白质提取试剂盒提取细胞总蛋白，于酶标仪中进行蛋白定量，并置于沸水中煮5～10 min至蛋白变性，室温冷却后，-80 ℃冰箱保存备用。配置10%SDS分离胶及5%浓缩胶，插入相应大小的梳子，加入蛋白样品及蛋白marker进行电泳及转膜，载有蛋白的PVDF膜经5%脱脂牛奶封闭90min后，加入PKCβ1、MEK1/2，MMP9，PCNA，β-actin一抗4℃过夜。次日TBST洗膜3次，每次10 min，后加二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，增强型ECL工作液显影，于BIO-RAD成像中曝光成像，计算相应的光密度比值。

2 结果

2.1 PKCβ1、MEK1/2在正常、EMs在位、EMs异位内膜中的表达：PKCβ1、MEK1/2在间质细胞和腺上皮细胞中均有表达，见图1-图6(封三)。EMs在位内膜组、异位组中PKCβ1、MEK1/2的表达高于正常子宫内膜组，且异位内膜组的表达高于在位内膜组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 PKCβ1、MEK1/2在3组子宫内膜组织中的表达

2.2 PKCβ1、MEK1/2、MMP9、PCNA在子宫内膜异位症组及正常对照组间质细胞中的表达：EMs在位内膜间质细胞中PKCβ1，MEK1/2的表达高于正常对照组间质细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。EMs在位内膜间质细胞中MMP9、PCNA的表达高于正常对照组间质细胞，差异有统计学意义(P<0.05)，提示EMs在位内膜间质细胞的侵袭和增殖性高于正常对照组间质细胞，见图7(封三)。

2.3 Pearson相关性分析：子宫内膜异位症间质细胞中PKCβ1和MEK1/2的表达呈正相关(r=0.84，P<0.05)，PKCβ1和MMP9的表达呈正相关(r=0.77，P<0.05)，PKCβ1和PCNA的表达呈正相关(r=0.81，P<0.05)。MEK1/2和MMP9的表达呈正相关(r=0.82，P<0.05)，MEK1/2和PCNA的表达呈正相关(r=0.70，P<0.05)，提示PKCβ1和MEK1/2与间质细胞的侵袭和增殖性相关。

3 讨论

子宫内膜异位症是育龄期妇女常见的雌激素依赖性疾病，其特征是子宫内膜样组织腺体或间质出现在子宫腔以外的部位，常伴有瘢痕形成和粘连。但其病因和发病机制目前尚不清楚。

蛋白激酶C(Protein kinase C)由11个酯类依赖的丝氨酸/苏氨酸激酶家族组成，它们影响多种细胞功能，包括增殖、分化和凋亡。PKC同工酶在多种癌症中有表达变化，参与多种癌症的发生发展[4]，PKCβ1参与了细胞分化增殖凋亡和血管生成等生物学过程。研究发现激活PKC信号通路可以促进子宫内膜的生长发育[5]。Meola[6]等通过基因芯片检测发现PKCβ1在子宫内膜异位症异位内膜组织中表达增高。本研究中PKCβ1在子宫内膜异位症在位及异位内膜组织中的表达高于正常对照组，且异位内膜中的表达高于在位内膜，验证了PKCβ1与子宫内膜异位症的关系。进一步分离培养原代子宫内膜间质细胞，通过Western-blot检测了间质细胞中PKCβ1的表达，结果表明子宫内膜异位症间质细胞中PKCβ1的表达水平明显高于正常对照组间质细胞，差异具有统计学意义。

MAPK信号通路通常由RAS、RAF、MEK、ERK组成，引发涉及MEK的级联反应，进而激活ERK，在调节真核细胞的基因表达中起重要作用，该信号通路控制着细胞生长、增殖、分化和迁移等细胞过程[7]。MAPK参与多种肿瘤的发生发展，在卵巢癌[8]中MAPK被异常激活，诱导肿瘤细胞的异常增殖、侵袭和黏附。多项研究表明，MAPK在子宫内膜异位症中被激活，参与调节子宫内膜异位症的发病机制，子宫内膜异位症患者的异位子宫内膜细胞的增殖和存活与MAPK信号通路的异常激活有关[9]。在子宫内膜异位症中MAPK信号通路在细胞增殖、凋亡和迁移的调节中起着重要作用，可能通过增强子宫内膜异位间质细胞在体外纤维化微环境中的增殖和存活来支持子宫内膜异位病变的生长[10]。因此MAPK信号通路的组成性激活参与多种癌症的发生，而MEK1/2是MAPK信号级联反应的重要组成部分，在MAPK级联反应中起着至关重要的作用[11]，主要功能是参与细胞生长、增殖和分化。在本研究中发现MEK1/2在子宫内膜异位症在位及异位内膜组织中的表达高于正常对照组，且异位内膜中的表达高于在位内膜，子宫内膜异位症间质细胞中MEK1/2的表达水平明显高于正常对照组间质细胞。

基质金属蛋白酶9(MMP9)是介导细胞侵袭的关键酶，子宫内膜组织和外周血中MMP9水平的改变是EMs发生的重要危险因素[12]。研究发现MMP9在EMs始终高表达[13]，与没有子宫内膜异位症的妇女子宫内膜相比，MMP9的含量更高，具有更强的侵袭性[14]。多项研究已经检测到与健康对照组相比，子宫内膜异位症妇女腹水、血液、血浆、腹腔液、血清和尿液中MMP9蛋白水平显著升高[15]。增殖细胞核抗原(PCNA)是细胞核中的一种酸性蛋白，是合成所必需的辅酶，PCNA水平代表细胞的增殖活性。本研究也发现MMP9、PCNA在子宫内膜异位症间质细胞中存在高表达，相关性分析发现MMP9、PCNA与PKCβ1，MEK1/2存在正相关关系，但其具体的调节机制还有待进一步研究。