葡萄柚籽提取物和聚乙烯包装处理对香椿贮藏期微生物变化的影响

林少华，阿依图拉·拜各吐木尔，陈存坤，张慧杰，罗红霞*，李相阳*，许文涛

葡萄柚籽提取物和聚乙烯包装处理对香椿贮藏期微生物变化的影响

林少华1，阿依图拉·拜各吐木尔2，陈存坤3，张慧杰4，罗红霞1*，李相阳2*，许文涛5

(1. 北京农业职业学院食品与生物工程系，北京 102442；2. 食品质量与安全北京实验室，农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京农学院食品科学与工程学院，北京 102206；3. 国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津），天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津 300384；4. 天津科技大学食品工程与生物技术学院，食品营养与安全省部共建教育部重点实验室，天津 300457；5. 中国农业大学食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100083)

基于香椿因采摘期短、季节性强和极易腐烂变质等问题，以二茬香椿为原料，采用不同浓度的葡萄柚籽提取物（GSE）和聚乙烯（PE）包装对其进行保鲜处理，测定其贮藏期间的菌落总数、霉菌酵母菌数及细菌和真菌的生物多样性。结果表明，0.5% GSE结合PE保鲜膜处理组能够有效地抑制菌落总数以及霉菌酵母菌数的增长；优势细菌门为蓝菌门（）和变形菌门（），优势细菌属为产碱菌属（）和红色杆菌属（）；优势真菌门为子囊菌门（）和担子菌门（），优势真菌属为短梗霉属（）和斯宾塞马丁氏孢菌属（）。香农指数和主成分分析结果表明，0.5% GSE结合PE保鲜膜处理组的细菌和真菌生物多样性最低，微生物群落更加稳定。

葡萄柚籽提取物；聚乙烯包装；香椿；贮藏保鲜；微生物

近年来，由于抗菌活性和安全性，利用天然提取物对果蔬进行保鲜处理以控制其腐烂，延长其贮藏时间，越来越受到人们的重视[1-2]。这些天然提取物包括了中草药植物浸提液、天然植物精油和动物源提取物等动植物原料，它们具有操作简便、处理成本低及无污染等优点，从而得到了快速的发展[3]。作为木本蔬菜的香椿（），因采摘期短，水分含量高、营养丰富，极易腐烂变质[4]。研究者们也分别采用物理和化学等方法对其保鲜处理，但采用天然提取物等生物保鲜技术的研究较少。陈丽娟等[5]采用外源甜菜碱对香椿进行处理，香椿嫩芽在贮藏期间的质量损失和腐烂现象得到了控制。

葡萄柚籽提取物（Grapefruit seed extract，GSE）是一类来源于葡萄柚种子和果肉中的提取物，它含有丰富的多酚化合物、类黄酮（柚皮苷）、柠檬酸、抗坏血酸、生育酚、柠檬酸和其他微量化合物[6]，具有抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗寄生虫等作用[7-9]，并被证明安全、无人体毒性[10]，广泛应用于食品加工、制药和化妆品行业[11-12]。研究表明，GSE能够抑制鲜切绿色蔬菜上的细菌性病原体，并延长其保存时间[13]；它还通过延迟感官和视觉特性方面与变质相关的参数，有效地降低了“红地球”葡萄贮藏期间的腐烂率，并延缓了其质量的下降[14]。此外，采用保鲜膜对蔬菜进行包装处理是常用的延缓水分流失的主要方式[15]，PE膜韧性、防潮性和热塑封性均良好，且价格便宜，常用于蔬菜的贮藏保鲜[4, 16-18]。本实验室前期研究了GSE+PE处理香椿采后贮藏过程中品质变化的影响（相关研究成果另文发表），在此基础上，本文重点研究了GSE+PE处理对香椿采后贮藏过程中微生物数量和生物多样性变化的作用，以期为该保鲜处理的可行性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

二茬香椿，北京市门头沟区雁翅镇苇子水村现采摘；GSE，中国农业大学食品营养与人类健康高精尖创新中心；菌落总数测试片、霉菌酵母菌测试片，广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司；PE膜（厚度为0.02 mm，O2渗透率是7.15 Lm-2·d-1·atm-1，CO2渗透率是23.14 Lm-2·d-1·atm-1，水蒸气透过率为5.15 g·m-2·d-1），国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津）；DNA提取试剂盒，北京福德安科技（北京）有限公司；10×PCR buffer、dNTP、DNA聚合酶和10×Loading buffer，宝生物工程（大连）有限公司；引物、DNA Marker（分子量范围为100 ～ 1 500 bp），赛默飞世尔科技公司。

1.2 仪器设备

MDF-382E超低温冰箱，日本三洋电机公司；5804 R离心机，艾本德中国有限公司；ALD1244 PCR扩增仪和CFX96定量PCR仪，伯乐生命医学产品（上海）有限公司；E凝胶成像仪，美国UVP公司；Miseq高通量测序仪，美国Illumina公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理 现场戴一次性手套采摘成熟度和长度基本一致的二茬香椿，并置于PE保鲜袋中3 h内常温运回实验室进行保鲜处理，操作人员均戴一次性手套。试验样品随机分为4 组，每组10份，每份重500 g，并进行以下处理：CK组（对照组），选用0.02 mm厚度的PE保鲜膜包裹；0.1% GSE组、0.3% GSE组和0.5% GSE组为：将香椿分别浸泡在质量浓度为0.1%、0.3%和0.5%的常温GSE溶液中1 min。GSE溶于灭菌后的蒸馏水中，香椿从GSE溶液中捞出后置于经过75%酒精擦拭后的台面上晾4 h，然后用0.02 mm厚度的PE保鲜膜包裹。所有处理组均贮藏于温度为（1 ± 0.5）℃，湿度为（90 ± 5）%的冷库中，分别于0、8、16、24 和32 d进行取样，每次样品置于–80 ℃超低温冰箱中进行冷冻保存，备用于微生物多样性的检测，检测重复3次。

1.3.2 菌落总数和霉菌酵母菌数测定 菌落总数和霉菌酵母菌数测定按照绿洲生化牌菌落总数测试片和霉菌酵母菌测试片的操作方法进行培养和计数。

1.3.3 微生物多样性的测定 样品的细菌和真菌的生物多样性的测定参考Lin等[4]的方法。

1.4 数据处理

采用Excel 2017软件对数据进行整理，运用SPSS 20.0（IBM，USA）软件对不同组间的数据进行显著性分析，并采用最小显著差数法（LSD）进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 菌落总数和霉菌酵母菌数的变化

不同处理组的香椿在贮藏期间的菌落总数和霉菌酵母菌数的变化情况结果（图1和图2）显示，GSE随着处理浓度的增加，对香椿贮藏期间菌落总数和霉菌酵母菌数量的抑制作用更强，这是因为随着GSE浓度的增大，多酚类物质的含量也相应增大，抗菌活性也相应增大[19]。多酚类物质能使微生物细胞膜的通透性增大，膜流动性受到影响，从而阻碍微生物蛋白质的表达，进而起到抑菌作用[20-22]。张南等[19]研究发现，能使酿酒酵母细胞核浓缩并导致核裂及 DNA 断链，并引起其细胞内活性氧大幅增加，诱导其凋亡。因此，GSE能有效地抑制细菌和真菌的繁殖。本文的研究结果与GSE在无淀粉火腿肠[23]、鸭梨果实[24]和香菇[25]等食品的贮藏保鲜结果一致。

*P < 0.05，**P < 0.01。下同。

Figure 1 Changes of total plate count ofin different treatment groups

2.2 香椿贮藏期间微生物多样性的变化

2.2.1 细菌门和属分类水平的变化 不同处理组的香椿在贮藏期间的细菌在门和属分类水平上的相对丰度变化情况分别如图3和图4所示。因32 d的CK处理组已腐烂，所以未对该处理组进行微生物多样性的测定。从图3可以看出，在测序发现的6个细菌门中，第一丰度的是蓝菌门（），该研究结果与紫外杀菌的保鲜处理方法的结果一致[26]，这表明蓝菌门较具有更高的耐受性。其次是变形菌门（），这是一类包括大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌的细菌门，其相对丰度在经GSE处理初期受到抑制。Palma等[27]研究发现，GSE对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等人类致病菌具有高度的抗菌活性。然而随着贮藏时间的延长，变形菌门丰度的增加也意味着香椿表面致病菌的丰度也存在增加的可能性。从图4可以看出，在前十大相对丰度高的属中，产碱菌属（）和红色杆菌属（）的相对丰度占绝对优势，其中，产碱菌属在经GSE处理的当天相对丰度最高，这表明GSE对该菌属的抑制作用最小；然而，随着香椿贮藏时间的延长，4个处理组的产碱菌属的相对丰度总体呈现下降趋势，可能是由于其他菌属微生物的生长繁殖导致的。但红色杆菌属的相对丰度则随着贮藏时间的延长而上升，红色杆菌属属于放线菌门（），图3中的结果表明放线菌门的相对丰度也呈上升趋势。

图2 不同处理组的香椿霉菌酵母菌数变化

Figure 2 Changes of molds and yeasts ofin different treatment groups

图3 门水平下细菌生物多样性的变化

Figure 3 Variation of bacterial biodiversity at phylum level

图4 属水平下细菌生物多样性的变化

Figure 4 Variation of bacterial biodiversity at genus level

图5 门水平下真菌生物多样性的变化

Figure 5 Variation of fungal biodiversity at phylum level

图6 属水平下真菌生物多样性的变化

Figure 6 Variation of fungal biodiversity at genus level

2.2.2 真菌门和属分类水平的变化 不同处理组的香椿在贮藏期间的真菌在门和属分类水平上的相对丰度变化情况分别如图5和图6所示。从图5可以看出，香椿在贮藏期间有3个门，其中，优势真菌门为子囊菌门（）和担子菌门（）。子囊菌门的相对丰度随着贮藏时间的延长而下降，但担子菌门的相对丰度则上升，与紫外、1-MCP和乙烯吸附剂等保鲜处理的结果一致[26]。从图6可以看出，在前十大相对丰度最高的属中，短梗霉属（）和斯宾塞马丁氏孢菌属（）的相对丰度占绝对优势，其中，短梗霉属的相对丰度随着香椿贮藏时间的延长而下降，但斯宾塞马丁氏孢菌属的相对丰度则上升。

2.3 样品香农指数和主成分分析

不同GSE浓度处理的香椿在贮藏期间的细菌和真菌香农指数（Shannon）如图7所示。香椿经过0.5%GSE处理后，其细菌和真菌的生物多样较CK组差异极显著（< 0.01），较0.1%GSE组差异显著（< 0.05），但细菌的生物多样性与0.3%GSE组差异不显著，而真菌则差异显著（< 0.05）。研究结果表明，具有杀菌作用的GSE能够显著降低细菌和真菌的生物多样性，该结果与紫外杀菌处理的香椿的生物多样性结果基本一致[26]。

ns 为差异不显著，*P < 0.05，**P < 0.01。

Figure 7 Shannon indexes of bacteria and fungi ofin different treatment groups

图8 不同处理组的细菌主成分分析

Figure 8 Principal component analysis of bacteria in different treatment groups

图9 不同处理组的真菌主成分分析

Figure 9 Principal component analysis of fungi in different treatment groups

为了全面了解不同GSE浓度处理的香椿在贮藏期间的细菌和真菌的整体变化情况，进行了主成分分析（PCA），结果（图8和图9）表明，0.5%GSE处理的细菌和真菌PCA在贮藏期间聚集在一起，而其他处理组的PCA结果较离散，因此，0.5%GSE处理能够有效地控制和保持香椿在贮藏过程中的细菌和真菌生物多样性的稳定。

3 结论

本研究以二茬香椿为原料，采用不同浓度的葡萄柚籽提取物（GSE）和聚乙烯（PE）包装对其进行保鲜处理，并测定其贮藏期间的菌落总数、霉菌酵母菌数及细菌和真菌的生物多样性。本试验从微生物数量和多样性的角度探讨GSE改善香椿贮藏保鲜品质的原因。试验结果表明，0.5%GSE结合PE保鲜膜处理组能够有效地抑制菌落总数以及霉菌酵母菌数的增长；优势细菌门为蓝菌门（）和变形菌门（），优势细菌属为产碱菌属（）和红色杆菌属（）；优势真菌门为子囊菌门（）和担子菌门（），优势真菌属为短梗霉属（）和斯宾塞马丁氏孢菌属（）；香农指数和主成分分析结果表明，0.5%GSE结合PE保鲜膜处理组的细菌和真菌生物多样性最低，微生物群落的多样性更加稳定，从而保证了香椿的贮藏品质和安全。

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Effects of grapefruit seed extract and polyethylene packaging on microbial changes ofduring storage

LIN Shaohua1, Ayitula·Baigetumuer2, CHEN Cunkun3, ZHANG Huijie4, LUO Hongxia1, LI Xiangyang2, XU Wentao5

(1. Department of Food and Biological Engineering, Beijing Vocational College of Agriculture, Beijing 102442;2.Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue, Faculty of Food Science and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206; 3. National Engineering Technology Research Center for Preservation of Agricultural Products, Key Laboratory of Storage of Agricultural Products, Ministry of Agriculture and Rural Affair, Tianjin Key Laboratory of Postharvest Physiology and Storage of Agricultural Products, Tianjin 300384;4. College of Food Engineering and Biotechnology, State Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457; 5. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, China Agricultural University, Beijing 100083)

Because of its short picking period and strong seasonality,is easy to rot and deteriorate. In this study, the second crop ofwas used as the raw material, and different concentrations of grapefruit seed extract (GSE) and polyethylene (PE) packaging were used for preservation treatment. The total number of colonies, the number of molds and yeasts and the biodiversity of bacteria and fungi were determined during storage. The results showed that 0.5% GSE combined with PE preservative film could effectively inhibit the growth of the total number of colonies and the number of molds and yeasts; the dominant phylum of bacteria wereand; the dominant genus of bacteria wereand; the dominant phylum of fungi wereand; the dominant genus of fungi wereand. The results of Shannon index and principal component analysis showed that 0.5% GSE combined with PE film had the lowest diversity of bacteria and fungi, and the microbial community was more stable.

grapefruit seed extract; polyethylene packaging;; storage and preservation; microorganism

TS255.3

A

1672-352X (2021)03-0367-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210706.016

2021-7-7 10:07:22

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210706.1648.032.html

2020-07-28

北京市财政支持特高校建设专项-科技小院建设项目（PXM2020-157102-000028），食品营养与安全应用技术协同创新中心项目（PXM2021_157102_000005）和万人计划教学名师特殊支持项目（2020-00808）共同资助。

林少华，副教授。E-mail：lsh_hp@sina.com

罗红霞，博士，教授。E-mail：hongxiajun@163.com 李相阳，博士，副教授。E-mail：lxy2002cn@163.com