一株纤维素降解菌的分离、鉴定及发酵优化

李文兵，毕江涛，惠治兵，刘 鹏，王 兵，孙 权

一株纤维素降解菌的分离、鉴定及发酵优化

李文兵1，毕江涛2*，惠治兵1，刘 鹏1，王 兵3，孙 权1

(1. 宁夏大学农学院，银川 750021；2.宁夏大学生态环境学院，银川 750021；3. 宁夏壹泰丰生态肥业有限公司，银川 750100)

纤维素降解菌在堆肥发酵中具有加快腐熟、提升堆肥品质的作用，其中抗逆性强的芽孢杆菌属具有一定的优势。从新鲜牛粪中筛选具有降解粪污能力的纤维素降解菌，通过羧甲基纤维素钠培养基与革兰氏碘液结合培养、滤纸摇瓶复筛，并进行形态学观察、生理生化分析、16S rDNA基因序列对比鉴定，获得一株纤维素降解菌CK41，经NCBI提交序列BLAST比对后，鉴定为内生芽孢杆菌（）（登录号：MT023630）。研究结果显示，利用单因素试验和响应面优化产酶条件试验，在温度为37 ℃，时间为72 h，pH为7.0，接种量为4%（）时，获得羧甲基纤维素酶活量3.14 U·mL-1，较优化前提高了149.5%。结果表明，温度、时间和pH对于羧甲基纤维素酶活力是重要影响因素，接种量影响程度较小。菌株CK41具有较强的纤维素酶生产能力，在堆肥发酵中具有一定的潜力。

堆肥；纤维素降解菌；内生芽孢杆菌；分离；鉴定；响应面优化

我国是世界上畜禽养殖废弃物产出量最大的国家[1]，每年产生的粪便量超过30亿t[2]，大量的畜禽粪便排放堆积，造成的环境问题日益突出，如造成地下水面源污染、臭气排放以及病原菌排入土壤等严重影响作物产量。堆肥发酵被认为是畜禽粪便资源化利用的有效方式之一[3]。畜禽粪便主要成分为纤维素类物质[4]，利用自然界的微生物分泌大量胞外酶将纤维素类大分子物质降解为腐殖质[5-6]，与物理和化学法相比具有安全、环保无污染的特点[7]。堆肥不仅解决了环境污染问题，还能将废弃物制成肥料产生一定的经济效益[8]。

传统堆肥存在功能微生物少，发酵周期长，腐熟程度低的问题[9]，因此需要人工添加外源菌剂，提高微生物的数量，缩短堆肥周期，提升腐熟品质[8]。吴庆珊[10]筛选出具有纤维素降解能力的芽孢杆菌属（）和类芽孢杆菌属（），将其制成菌剂应用于羊粪堆肥中，提高或维持了堆体高温发酵，缩短了堆肥和腐熟周期；周勇[11]将枯草芽孢杆菌（）应用于猪粪堆肥中，大大缩短了堆肥周期，使物料完全达到了腐熟状态；诸葛诚祥[12]从菌糠中筛选出高效纤维素降解菌属：短芽孢杆菌属（）和芽孢杆菌属，将其制成菌剂应用于堆肥中，相较于对照组，缩短了堆肥周期，提升了肥效。细菌具有易繁殖、适应性强、培养周期短等特点[13]，特别是芽孢杆菌属具有耐高温、耐酸碱、产羧甲基纤维素酶活力较高等特点[14]。因此，从堆肥菌剂的角度出发，纤维素降解能力强的芽孢杆菌具有一定的发展潜力。

本研究从宁夏某牧业养殖场采集牛粪，分离出一株具有纤维素降解功能的芽孢杆菌，对其进行形态学观察，16S rDNA基因序列分析，并进行发酵条件优化，以期为畜禽养殖业粪污堆肥资源化利用提供微生物菌种资源。

1 材料与方法

1.1 样品来源

本试验菌源样品采集于宁夏某牧业养殖场。采样时去除杂质，装入采样袋中并编号，带回实验室，并于4 ℃保存。

1.2 培养基与试剂

（1）LB培养基（g·L-1）：用于纤维素降解菌株的富集培养。胰蛋白胨10.0、酵母浸膏粉5.0、NaCl 10.0，1×105Pa灭菌30 min。

（2）牛肉膏蛋白胨培养基（g·L-1）：用于纤维素降解菌的分离。牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、琼脂20.0，1×105Pa灭菌30 min。

（3）羧甲基纤维素钠培养基（CMC-Na培养基）（g·L-1）：用于高效纤维素降解菌的筛选。羧甲基纤维素钠（CMC-Na）20.0、Na2HPO42.5、KH2PO41.5、蛋白胨2.5、酵母浸膏粉0.5，琼脂20，pH调至7.0，1×105Pa灭菌30 min。

（4）发酵培养基[15]（g·L-1）：用于测定酶活。麸皮50.0、蛋白胨3.0、NaCl 5.0、(NH4)2SO43.0、KH2PO41.0、MgSO4·7H2O 0.3，用NaOH饱和溶液调至pH 7.0，1×105Pa灭菌30 min。

（5）滤纸条崩解培养基[16]（g·L-1）：经滤纸条崩解试验可进一步判断出菌株的降解能力。(NH4)2SO43.0、KH2PO41.0、MgSO4·7H2O 0.4、酵母浸膏粉0.1，pH 7.0，1×105Pa灭菌30 min。

（6）革兰氏碘液：用于纤维素水解圈的测定。KI 2.0 g，I21.0 g，H2O 300 mL。

（7）DNS 试剂（3, 5二硝基水杨酸）按照农业部标准DNS试剂配制，柠檬酸缓冲溶液、葡萄糖标准溶液按照QB 2583­—2003 标准配置。

1.3 纤维素降解菌的筛选

1.3.1 富集培养 取4 ℃保存的新鲜牛粪10.0 g装入装有90 mL无菌水的250 mL三角瓶中，连续震荡30 min混匀。取1 mL接入LB液体培养基进行富集12 h。

1.3.2 初筛 将富集后的粪便混合液做标准溶液浓度稀释，分别取稀释度为10-8、10-9和10-10倍的菌液200 μL涂抹于牛肉膏蛋白胨培养基上，每个稀释梯度做3个重复，培养基置于28 ℃培养箱培养24 h，挑取不同形态的单菌落于牛肉膏蛋白胨培养基中，纯化3～4代斜面接种后置于4 ℃冰箱中保存备用；将纯化后的菌株点接于CMC-Na培养基，28 ℃倒置培养12 h，加入革兰氏碘液浸染5～10 min，观察有无明显水解圈，并用游标卡尺测量培养基中菌落的透明圈直径（，cm）与菌落直径（，cm），计算二者的比值，根据比值大小初步确定分离菌株纤维素酶活力的高低。

1.3.3 复筛 选取比值较大的菌株分别接种于液体发酵培养基，28 ℃、150 r·min-1震荡培养24 h，5 000 r·min-1离心10 min，取上清液用于后续纤维素酶活的测定。纤维素酶活采用DNS法[17]。酶活力单位（U）规定为：在特定条件下，1 min内转化1 μmoL底物，或者底物中1 μmoL有关基团所需的酶量。

内切 β-1, 4-葡萄糖苷酶（简称EG或Cx酶）活性的测定：采用羧甲基纤维素（CMC）酶活性测定方法。在25 mL具塞比色管中加入用磷酸缓冲溶液配制的质量浓度为1%的CMC-Na溶液1 mL，加入待测酶液0.5 mL，50 ℃具塞水浴30 min，加入2.0 mL DNS试剂，具塞沸水浴5 min，立即冷却，蒸馏水定容至25 mL，摇匀后在波长540 nm处测定吸光度值，每管做5个重复，取平均值，通过查葡萄糖标准曲线求出还原糖的含量。

外切 β-1, 4-葡萄糖苷酶（简称CBH或C1酶）活性的测定：采用微晶纤维素（MCC)酶活性测定法。取1 mL用pH 7.0 的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液配制的2 g·L-1微晶纤维素溶液，加入1 mL待测酶液，于50 ℃水浴条件下反应 2 min后，5 000 r·min-1离心5 min。然后取1 mL反应上清液加入1 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，再加入2 mL DNS试剂，沸水浴中煮沸 10 min，冰浴冷却后于 540 nm处比色。

纤维素酶总活性的测定：采用滤纸酶活性（FPA检测法）。在25 mL比色管中加入1 cm × 5 cm的滤纸条，加入待测酶液0.5 mL，其余同羧甲基纤维素酶活性的测定方法一致。

葡萄糖标准曲线的绘制：取无水葡萄糖（80 ℃烘至恒重）配置成1 mg·mL-1的葡萄糖标准溶液，分别取此标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mL补加蒸馏水至2 mL，加DNS试剂2 mL具塞沸水浴30 min，冰浴冷却至室温，定容至25 mL，反复摇匀在540 nm波长处测定吸光度值，每管3个重复，取平均值，以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线并建立回归方程。

滤纸条崩解试验：取5.0 mL液体发酵培养基中的培养液加入盛有100 mL滤纸条崩解培养基的三角瓶中，每个三角瓶放入1/4 Φ 9 cm的扇形滤纸，于28 ℃、150 r·min-1条件下摇瓶培养，以未加菌株的摇瓶作为对照，观察滤纸条崩解情况。

1.4 菌株鉴定

1.4.1 形态学观察 将复筛出的菌株接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，28 ℃培养12 h，观察单菌落的生长状况和形态特征。菌株的生理生化特征描述参照《常见细菌系统鉴定手册》。

1.4.2 分子生物学鉴定 将菌株接种于斜面送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，利用微生物16S rDNA通用引物 27F(5´-AGAGTTTGA TCATGGCTCAG-3´)、1492R (5´-TAGGGTTACCT TGTTACGACTT-3´)对菌株进行16S扩增。PCR反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30次，72 ℃延伸10 min。将测定的序列通过NCBI进行BLAST比对，选择同源性较高的菌株序列构建系统发育树，初步确定筛选菌株的种属和系统发育关系。

1.5 发酵条件优化

1.5.1 优化结果评价标准 羧甲基纤维素酶是纤维素酶的重要组成部分，其酶活力一般也高于其他纤维素酶。因此本优化以羧甲基纤维素酶活力作为评估标准。

1.5.2 单因素优化 在液体发酵培养基上，依次对发酵时间（12、24、36、48、60、72、84和96 h）、pH（5、6、7、8和9）、培养温度（28、31、34、37、40和43 ℃）和接种量（2%、3%、4%、5%和6%，）这4个因素进行单因素优化，观察其对产纤维素酶的影响。

1.5.3 响应面优化及验证 根据单因素优化的结果，选择显著因素根据Box-Benhnken试验设计，利用Design-Expert 8.0进行多元回归拟合分析，以羧甲基纤维素酶活（Y）为评价指标，分别选取发酵时间（A）、发酵温度（B）、pH（C）及接种量（D）4个影响因素，优化最佳产酶条件，最后验证模型的准确性。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的筛选

2.1.1 菌株初筛 从新鲜牛粪中分离出4株具有纤维素分解能力的菌株，通过富集及在CMC-Na培养基上经革兰氏碘液染色筛选透明圈直径比值（D/d）较大的菌株，分别命名为CK12、CK41、FE21和ZF22，其菌落直径测定结果如表1所示。CK41菌株菌落直径明显大于其他3株菌，说明该菌株在CMC-Na培养基上生长良好，菌株CK41的D/d值为4.83，高于其他3株菌，初步说明菌株CK41的纤维素降解能力高于其他3株菌。

2.1.2 菌株复筛 利用DNS法对初筛得到的具有纤维素降解能力的菌株进行复筛，以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标制作回归曲线，回归方程为0.273 90.009 8，相关系数R为0.993 1，表明标准曲线线性关系良好。从表1中看出菌株CK41的CMC、MCC和FPA值均高于其他菌株。将菌株富集后以一定量接入滤纸条崩解培养基中，每天观察培养基中的滤纸变化情况。2 d后对照培养基澄清，接菌的培养基开始变浑浊，3 d后滤纸边缘开始毛化，5 d后CK12、CK41、FE21和ZF22均出现了不同程度的破碎、分解，且CK41滤纸碎裂程度最大（图1），而对照培养基依旧清澈透明。由此说明CK41菌株降解纤维能力较强。

2.2 菌株生理生化特征及其系统发育关系

菌株CK41在牛肉膏蛋白胨平板上28 ℃培养12 h进行观察：菌落呈圆形，边缘不整齐，表面无凸起，扁平、光滑无褶皱，白色，如图1所示。经革兰式染色，显微镜观察，菌体为细杆状，革兰氏染色呈阳性，并做了相应的生理生化特征实验，如吲哚实验、耐碱性实验、淀粉利用实验等（表2）。

该菌株经DNA提取、PCR扩增获得16S rDNA片段长度1 500 bp，经BLAST比对，得到该菌株与内生芽孢杆菌的同源性为100%。选取亲缘关系较近的菌株运用MEGA7.0的N-J法建立系统发育树（图2），结合形态学观察，确定菌株CK41是内生芽孢杆菌（），提交基因序列到GenBank后，获得登录号（MT023630）。

表1 D/d和纤维素酶活测定结果

图1 菌株CK41初筛、复筛、形态学观察和革兰氏染色结果

Figure 1 Primary screening, rescreening, morphological observation and gram staining results of strain CK41

表2 菌株CK41的生理生化特征

注：“+”为阳性；“-”为阴性。

图2 菌株CK41系统发育树

Figure 2 Phylogenetic tree of strain CK41

2.3 发酵条件优化

2.3.1 单因素优化结果 分别对菌株CK41发酵时间、温度、pH和接种量进行单因素优化，结果如图3所示。从图3（a）可以看出：随着温度的增加，羧甲基纤维素酶活力逐渐升高；当发酵温度到37 ℃时酶活力最高，为2.50 U·mL-1，当温度超过37 ℃时酶活力急剧下降。由图3（b）可知：随着发酵时间的增加，酶活力逐步升高；当发酵时间为72 h时酶活力最高，为2.25 U·mL-1；当发酵时间超过72 h时，酶活力开始下降。由图3（c）可知：pH在5～6间酶活力增速缓慢，pH在6～7时酶活力迅速升高；当pH值为7.0时酶活力最高，为1.31 U·mL-1；当pH大于7时，酶活力开始下降。从图3（d）可看出：随着接种量的增加酶活力逐渐升高；当接种量为4%时酶活力最高，为1.94 U·mL-1；当接种量大于4%时，酶活力开始下降。因此，发酵所选择的最优条件为：时间72 h，发酵温度37 ℃，pH 7.0，接种量4%（）。

2.3.2 响应面优化结果 为了进一步优化菌株CK41的产酶条件，根据单因素优化结果，选取发酵时间、温度、pH和接种量作为影响因素，以羧甲基纤维素酶活力作为响应值进行Box-Benhnken试验。试验因素与水平如表3所示，试验设计和结果如表4所示。

利用Design-Expert 8.0 软件对试验数据进行二次回归方程拟合，得到羧甲基纤维素酶活（Y）与温度（A）、时间（B）、pH（C）和接种量（D）的二次回归方程为：= 3.13 + 0.083+ 0.065+ 0.051–0.087–0.02–(2.5×103)+ 0.04–0.05–0.11+ 0.02–0.422–0.42–0.472–0.42, 其中为预测值。

P>F<0.05，表明模型拟合度好，可以利用响应面模型进行后续优化设计[18]。从表5中值可以看出，方程中A、B、C、D、BD、A2、B2、C2和D2对Y值的影响极显著，表明试验因子对响应值不是简单的线性关系，二次项与响应值的关系很大；交互项AB、AC、AD、BC和CD对Y值的影响不显著。其校正决定系数R= 0.975 0，说明该模型能够解释97.5%响应值变化；RAdj= 0.950 1，表明该模型与数据拟合程度较好，试验误差较小；离散系数= 3.19% < 10% ，失拟项0.067 8 > 0.05，不显著，表明试验的可信度和精确度高。拟合回归方程符合以上检验原则，说明适应性好，即可用此模型和方程分析羧甲基纤维素酶活力。

图3 菌株CK41单因素优化结果

Figure 3 Single factor optimization results of strain CK41

表3 Box-Benhnken试验因素与水平

为了验证模型的准确性，根据单因素最优结果进行了5组平行试验，羧甲基纤维素酶活力均值为3.14 U·mL-1，与预测值3.13 U·mL-1基本一致，说明模型能够较好的应用于试验。

等高线图的形状可以反映出两因素交互作用的强弱，中心圈呈椭圆状表示两因素交互作用强，呈圆状表示交互作用弱[19]。在图4（a）—图9（a）中，等高线中心圈皆呈椭圆状，说明温度、时间、pH和接种量4因素两两交互作用较强，再结合表5交互项值可知，虽交互作用较强但不显著。

在响应面和等高线图中，所选的范围内存在极值, 既是响应面的最高点, 也是等高线最小椭圆的中心点[20]。图4（a）中，温度37 ℃与时间72 h相交；图7（a）中，时间72 h和pH 7.0相交；图8（a）中，时间72 h和接种量4%（）相交。所以37℃、72 h、pH 7.0和接种量4%（）处存在极大值，该结果与图3单因素优化结果一致。

表4 Box-Benhnken试验设计及结果

表5 回归系数显著性分析

注： ** 表示极显著（< 0.01）；* 表示显著（< 0.05）。

图4 温度与时间对羧甲基纤维素酶活影响的等高线图（a）和响应面图（b）

Figure 4 Contour diagram (a) and response surface diagram (b) of the influence of temperature and time on CMCase activity

图5 温度与pH对羧甲基纤维素酶活影响的等高线图（a）和响应面图（b）

Figure 5 Contour diagram (a) and response surface diagram (b) of the influence of temperature and pH on CMCase activity

图6 温度与接种量对羧甲基纤维素酶活影响的等高线图（a）和响应面图（b）

Figure 6 Contour diagram (a) and response surface diagram (b) of the influence of temperature and inoculation on CMCase activity

图7 时间与pH对羧甲基纤维素酶活影响的等高线图（a）和响应面图（b）

Figure 7 Contour diagram (a) and response surface diagram (b) of the influence of time and pH on CMCase activity

图8 时间与接种量对羧甲基纤维素酶活影响的等高线图（a）和响应面图（b）

Figure 8 Contour diagram (a) and response surface diagram (b) of the influence of time and inoculation amount on CMCase activity

图9 pH与接种量对羧甲基纤维素酶活影响的等高线图（a）和响应面图（b）

Figure 9 Contour diagram (a) and response surface diagram (b) of the influence of pH and inoculation amount on CMCase activity

响应面图考察在某个因素固定在中心值不变的情况下,其他两个因素的交互作用对羧甲基纤维素酶活的影响，曲面颜色向中心点逐渐加深，坡度越来越陡说明两因素交互越来越强[21]。图4（b）—图9（b）中，曲面的轮廓岭脊越来越陡，颜色越来越深，到达最高点时，酶活力不再增大反而下降，说明在达到极值前，因素间交互作用越来越强。同时，根据曲面颜色变化趋势不同，可以看出不同因素的重要影响程度。图5（b）中，随温度的增加，轮廓岭脊颜色开始由蓝变红，按重要影响程度分，温度比接种量的影响大；同理，图7（b）中，时间比接种量的影响大；图8（b）中，pH比接种量影响大。说明接种量是最小影响因素。再结合表5中单因素项值，可得出：温度、时间和pH等因素对于羧甲基纤维素酶活力是重要影响因素，接种量影响程度较小。

3 讨论与结论

芽孢杆菌属是自然界分布极广的一类细菌，因其具有芽孢，能够抵御外界有害因子，适应能力强的特点[22]广泛应用于堆肥中，成为目前研究产纤维素酶微生物的一个重要方向[23]。本研究从新鲜牛粪中分离得到一株纤维素降解菌CK41，通过对该菌株形态学观察、生理生化特征实验、分子鉴定等确定该菌株为内生芽孢杆菌（）。刘东阳等[24]以结晶纤维素作为唯一碳源，从牛粪中筛选出具有纤维素降解能力的蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌；张喜庆等[25]从牛粪中分离出高效纤维素降解菌，枯草芽孢杆菌，其羧甲基纤维素酶活力达100.81 U·mL-1；杨力等[26]从奶牛粪污中分离得到高产纤维素降解菌并经构建混合菌群，CMC酶活力高达1 617.92 U·mL-1。目前，关于具有纤维素降解能力的内生芽孢杆菌研究较少。袁春红[27]从黄水中分离得到内生芽孢杆菌菌株，其羧甲基纤维素酶活力为0.132 U·mL-1，与其相比，菌株CK41羧甲基纤维素酶活力为3.14 U·mL-1，具有一定的优势，从而为纤维素降解菌提供了一个新的品种。

单因素优化结果中（图3），当温度超过37 ℃时，酶活力急剧下降，高温会影响酶促反应动力学从而抑制代谢物的产生，菌株难以存活。当发酵时间超过72 h时，酶活力开始下降，一方面随着发酵时间的延长，水解产生的葡萄糖量随之增加，当葡萄糖的量达到一定时，抑制了内切葡萄糖苷酶的产生；另一方面，长时间的发酵导致菌株老龄化，菌株间争夺营养物质，代谢缓慢，酶活力下降。由于酶的活性部位通常含有酸性或者碱性基团，使每种酶有自己最适pH，pH小于或大于7.0均会影响酶活力。接种量过低，菌株繁殖需要更长时间，致酶活力低；接种量过高，菌株间争夺溶解氧及营养物质，代谢产生的物质可能会抑制自身繁殖，致酶活力下降。

本研究在单因素试验的基础上，选择影响较大的因素（温度、时间、pH和接种量）作为变量，利用响应面法试验次数少、周期短、精度高的优点, 对影响试验指标的各因子水平及其交互作用进行优化和评价[28]。以羧甲基纤维素酶活作为响应值建立二次回归模型。据各项检测指标表明，该模型可信度、精密度高，模型显著，可用该模型和方程分析羧甲基纤维素酶活力。由等高线和响应面图得出：4个变量两两间交互对羧甲基纤维素酶活力均产生较强影响；温度、时间和pH等单因素是影响羧甲基纤维素酶活力的重要因素，接种量对其影响较小。结果表明：温度为37 ℃、时间为72 h、pH为7.0、接种量为4%（）时获得羧甲基纤维素酶活为3.14 U·mL-1，较优化前的2.10 U·mL-1，提高了149.5%。

本研究所筛选的菌株下一步工作需要同其他功能菌株进行复合制成菌剂，并用于堆肥试验，以期发挥菌株之间的协同作用，提升堆肥品质。

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Isolation, identification and fermentation condition optimization of a cellulose degrading strain

LI Wenbing1, BI Jiangtao2, HUI Zhibing1, LIU Peng1, WANG Bing3, SUN Quan1

(1.School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021;2. School of Ecology and Environment, Ningxia University, Yinchuan 750021;3.Ningxia Yitaifeng Ecological Fertilizer Co. Ltd., Yinchuan 750100)

Cellulose degrading bacteria can accelerate the maturation and improve the quality of compost during composting fermentation, especiallystrain with strong stress resistance. In this study, we screened cellulose degrading bacteria with the ability to degrade manure from fresh cow dung, combined culture with Gram-iodine solution by sodium carboxymethyl cellulose medium, filter paper shaking flask, and morphological observation, physiological and biochemical analysis; we compared and identified 16S rDNA gene sequence and obtained a cellulose-degrading bacteria CK41, and identified it as(registration number: MT023630) after NCBI submission sequence alignment. The results showed that the carboxymethyl cellulase activity was 3.14 U·mL-1after the strain fermentation at 37 ℃ for 72 h in the medium of pH 7.0 with the inoculation amount of 4% (), which was 149.5% higher than before the optimization. The result indicated that temperature, time and pH value were important factors affecting carboxymethyl cellulase activity, while the inoculation amount had little effect. In conclusion, strain CK41 has strong cellulase production capacity and certain potential in composting fermentation.

composting; cellulose degrading bacteria;; isolation; identification; response surface optimization

X172

A

1672-352X (2021)03-0458-09

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210706.004

2021-7-7 11:43:27

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210706.1641.008.html

2020-08-15

宁夏重点研发计划（2018ZDKJ0312）资助。

李文兵，硕士研究生。E-mail：1323234800@qq.com

毕江涛，博士，研究员。E-mail：Bi_jt@nxu.edu.cn