HPLC测定小儿清热止咳口服液中苯甲酸的含量

尕藏卓玛 杨丽琼 达娃卓玛

西藏自治区食品药品检验研究院，西藏 拉萨 850000

小儿清热止咳口服液原方来自我国汉代名医张仲景的《伤寒杂病论》的麻杏石甘汤。麻杏石甘为麻黄、苦杏仁、石膏、甘草。本品现收载于《中国药典》(2015年版)一部，具有清热宣肺、平喘、利咽的功效，用于小儿外感风热所致的感冒，症见发热恶寒、咳嗽痰黄、气促喘息、口干音哑、咽喉肿痛。该方由麻黄、炒苦杏仁、石膏、甘草、黄芩、板蓝根、北豆根七味药组成，辅料为蜂蜜、蔗糖、苯甲酸钠[1]。已发表的文献主要报道了该制剂中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、黄芩苷及总黄酮的含量[2-5]。关于小儿清热止咳颗粒中辅料苯甲酸的质量控制未见文献报道。苯甲酸又称安息香酸，适量的苯甲酸防腐剂能抑制微生物的生长和繁殖，延长药品的保存期[6-7]。但过量的苯甲酸会对人体产生极大危害，对胃、皮肤和粘膜有一定的刺激性，对于敏感人群, 较多地摄入苯甲酸及其盐会引起过敏反应, 例如哮喘、荨麻疹、代谢性酸中毒和抽搐等症状[8-9]，过少起不到防腐效果。因而对小儿清热止咳颗粒中的防腐剂苯甲酸的用量应该严格控制。为保证用药安全，本实验对该制剂中苯甲酸的HPLC含量测定进行方法学研究，并对30家企业各2批次的苯甲酸含量进行测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-2030高效液相色谱仪(Labsolution工作站)，自带检测器，瑞士Mettler XP205型(精密度为十万分之一)和Mettler XP504(精密度为万分之一)电子天平。

1.2 试药 苯甲酸，购于中国食品药品检定研究院，批号为(100419-201302)，纯度大于99%。乙腈(色谱纯，美国Fisher Scientific公司)；水(娃哈哈纯净水)。

2 色谱条件

色谱柱Inertsustain C18(5 μm, 250 mm × 4.6 mm) 柱，柱温35℃；流动相：乙腈-0.02 mol/mL乙酸铵溶液(5∶95)；流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm；进样量：20 μL。

3 结果与讨论

3.1 检测波长的确定 用二极管阵列检测器对标准溶液在190 ～ 700 nm 范围内进行波长扫描，发现苯甲酸在223 nm处有最大吸收，如图1所示。根据样品特征及前处理过程中试剂的干扰情况，选择检测波长为240 nm。

图1 苯甲酸的HPLC紫外吸收图谱

3.2 对照品溶液的制备 取苯甲酸对照品适量，精密称定，置于50 mL的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，制成浓度为1.8044 mg/mL的对照品溶液。对照图谱如图2所示。

图2 苯甲酸的HPLC图谱

3.3 供试品溶液的制备 对30家企业57批次样品进行检验。精密吸取0.2 mL于10 mL的容量瓶中，以流动相稀释至刻度，摇匀。供试品图谱如图3所示。

图3 样品的HPLC图谱

3.4 标准曲线绘制 精密量取苯甲酸对照品母液6.8 mL于50 mL的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，制成245.3984 μg/mL的目标溶液。再分别精密量取0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5 mL分别置于10 mL的容量瓶中，以流动相稀释至刻度，摇匀。在上述色谱条件下分析，以对照品溶液的浓度为横坐标，其对应的纵坐标为峰面积进行线性回归，苯甲酸对照品在一定范围内与峰面积呈良好的线性关系，结果见表1和图4。

表1 线性回归方程及相关系数

图4 苯甲酸标准曲线图

3.5 检出限 取对照品溶液，稀释至对照品色谱峰高达到3倍信噪比，得到苯甲酸的检出限为9.816 ng/mL。

3.6 精密度 精密量取浓度为245.3984 μg/mL的苯甲酸对照品2.5 mL置于10 mL的容量瓶中，以流动相稀释至刻度，连续进样6次，测得苯甲酸峰面积RSD为0.053%，表明仪器精密度很好。

3.7 重复性 精密量取供试品溶液0.2 mL共6份，分别置于10 mL量瓶中，以流动相稀释至刻度，以0.45μm微孔滤膜过滤后进样分析，RSD 为1.81%。

3.8 稳定性 取同一供试品溶液，按上述方法提取后在室温下放置0、2、4、8、12、24 h在上述色谱条件下分析，测得苯甲酸峰面积RSD为0.412%，表明样品在室温下24 h内稳定。

3.9 加样回收试验 精密量取供试品溶液0.1 mL共6份，分别置于10 mL的容量瓶中，精密加入溶液浓度为245.3984 μg/mL的苯甲酸对照品1.0 mL，以流动相稀释至刻度。在上述色谱条件下进行分析，结果见表2。

表2 加样回收率

3.10 耐用性 精密量取供试品溶液0.2 mL共两份分别置于10 mL的容量瓶中，以流动相稀释至刻度，摇匀。采用不同色谱柱对同一样品在上述色谱条件下进行分析，色谱柱①岛津柱子InertSustain C18(5 μm, 250 mm × 4.6 mm)、②waters柱子XSELECT CSH C18(5 μm, 250 mm × 4.6 mm)③Agilent柱子 EcLipse XDB-C18(5 μm, 250 mm × 4.6 mm) 。不同柱子测得的结果RSD为1.48%，表明样品耐用性良好。见表3。

表3 耐用性

3.11 样品的测定 对于口服液体制剂，《中国药典》2015年版一部明确规定，苯甲酸含量不得超过0.3%[10]，对以上30家企业57批次样品的苯甲酸含量进行测定，结果显示，大部分厂家苯甲酸含量均匀，都在合格范围之内，个别企业苯甲酸含量很低，几乎为零，也有个别厂家的苯甲酸含量已超出合格范围。见表4。

表4 苯甲酸的含量

4 结论

苯甲酸本身毒性较大，故针对儿童药，世界上有许多国家已经禁止使用。但本次抽样的30家企业57批次样品均以苯甲酸为防腐剂，从检测结果来看，部分企业苯甲酸用量已经超标，这对消费者的健康而言具有较大的威胁，尤其小儿清热止咳口服液是儿童药，对于免疫系统和排毒代谢能力较弱的儿童来说，过量的防腐剂会对自身健康造成更大的危害[11]。故生产企业在生产过程中不能只考虑产量、销量，应该把消费者的健康利益放在首位。