EXOSC4对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制*

熊 畅，徐璐茜，王 元，林亚英，余进进

(1.江南大学附属医院妇产科，无锡 214000；2.江南大学无锡医学院，无锡 214000)

宫颈癌是世界上第四大最常见的癌症，同时也是发展中国家与癌症相关死亡的第二大原因[1]。宫颈癌是因高危人乳头瘤病毒(human papilloma viruses,HPV)持续感染所致[2]。然而高危HPV持续感染妇女中，只有小部分患者发展为宫颈癌[3-5]。迄今，宫颈癌发生、发展的机制尚未阐明，因此,进一步探讨宫颈癌进展的机制以及寻找新的治疗靶点具有重要意义。

EXOSC4(exosome component 4,EXOSC4)是外泌体的核心亚基之一，通常参与细胞的许多生理和病理功能，如RNA的降解等[6]。近年来有研究发现EXOSC4在促进结直肠癌发生中的致癌作用[7]。然而,EXOSC4在宫颈癌中的作用及机制尚未见报道。本研究探究了EXOSC4对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制，为宫颈癌分子诊断和预后提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

1.1.1 宫颈癌细胞 人宫颈癌细胞系HeLa、SiHa以及HCC94均由江南大学附属医院肿瘤研究所提供和保存。HeLa细胞由含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，SiHa及HCC94细胞由含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养,均置于37℃、5%CO2培养箱培养。

1.1.2 组织标本 收集3例来自江南大学附属医院行手术治疗的宫颈癌患者的组织标本，包括癌组织和癌旁组织，标本的采集经江南大学附属医院伦理委员会批准，并获得患者知情同意。

1.1.3 主要试剂 DMEM高糖培养基、RPMI 1640培养基、胎牛血清、青/链霉素购于美国BI公司；嘌呤霉素购自美国Sigma公司；干扰EXOSC4的慢病毒由苏州吉玛公司合成，序列：5'-GGCCCTAGTGAACTGTCAATA-3'(shEXOSC4)，阴性对照：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'(shNC)；TRIzol试剂购于南京诺唯赞生物科技有限公司，逆转录试剂盒和SYBR Green购于TaKaRa公司；CCK-8试剂购于日本Dojido公司；EXOSC4抗体购于Abcam，β-catenin抗体、c-myc抗体和cyclin D1抗体均购于CST，β-actin抗体购自中国上海碧云天公司。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔、山羊抗鼠二抗购于南京福麦斯公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel购于美国BI公司。

1.2.1 大数据应用 利用来自TCGA和GTEx数据库的GEPIA在线数据[8](http://gepia.cancer-pku.cn)分析EXOSC4在宫颈癌中的表达情况，Log2FC截断值设为1，P值截断值设为0.01。

1.2.2 细胞培养及慢病毒感染 宫颈癌细胞HeLa、SiHa以及HCC94均由江南大学附属医院肿瘤研究所提供和保存，其中HeLa细胞采用DMEM高糖培养基(10%胎牛血清)培养，SiHa和HCC94细胞采用RPMI 1640培养基(10%胎牛血清)培养，均于37℃、5% CO2培养箱培养。HeLa细胞密度达到30%～40%时，shEXOSC4慢病毒感染HeLa细胞并用嘌呤霉素筛选得到稳转株(shEXOSC4组)，转染其阴性对照作为对照组(shNC组)。

1.2.3 反转录和RT-qPCR检测各组HeLa细胞 用TRIzol试剂按厂家使用说明提取总RNA，用逆转录试剂盒进行cDNA逆转录，用SYBR Green试剂盒进行RT-qPCR，PCR反应程序为第一步，95℃ 30s；第二步95℃ 5s，60℃ 30s重复40次。用2-ΔΔCt方法评估mRNA表达。EXOSC4的引物序列：正向，GCTCGGCCTACATTGAGCAG；反向，GGACTTACGGTCCCCATGTG。β-actin的引物序列：正向，GTGGACATCCGCAAAGAC；反向，AAAGGGTGTAACGCAACTA。

1.2.4 蛋白免疫印迹实验(Western blot) 用RIPA蛋白裂解液收集组织和细胞中总蛋白，冰上裂解蛋白30min，低温10000×g离心，提取细胞裂解液。按BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书步骤测定蛋白浓度。配制SDS-PAGE凝胶后取样本(每个样本20μg)进行电泳，电泳条件:浓缩胶70V至蛋白Marker分离清晰后，改为110V直到溴酚蓝跑至胶底；转膜条件：SDS聚丙烯酰胺(PAGE)胶浓度根据为8%～12%，250mA转120min，转移至PVDF膜，50g/L脱脂牛奶封闭1h。TBST洗膜15min 3次，根据蛋白Marker剪膜，根据检测蛋白分子量，分别孵育一抗(抗体稀释比例EXOSC4 1∶400、β-actin 1∶1000、β-catenin 1∶1000、c-myc 1∶1000、cyclin D1 1∶1000)，4℃过夜，TBST洗膜3次，室温下孵育辣根过氧化物酶标记二抗(1∶5000)2h，TBST洗膜,曝光显影分析。采用Image J软件分析各条带的灰度值，目的蛋白的相对表达水平以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值之比表示。

1.2.5 CCK-8实验 将慢病毒转染稳定的shEXOSC4组和shNC组细胞分别于0h、24h、48h、96h，在96孔板中加含10μL/孔CCK-8试剂的培养基继续培养1h，在酶标仪(美国Bio-Tek公司)上450nm处检测光密度值(OD450)。

1.2.6 细胞克隆形成实验 将转染成功的HeLa细胞胰酶消化进行细胞计数，按800细胞/孔接种于6孔板。加2mL完全培养基培养10天，将培养基吸弃。PBS洗涤3次，1mL甲醇固定细胞30min，结晶紫染色10min，PBS洗涤3次，在光学显微镜下观察细胞拍照并计数。

1.2.7 细胞划痕实验 将转染稳定的两组HeLa细胞以106细胞/孔接种至6孔板，待细胞达到90%左右的汇合度时，用200μL枪头垂直划线，PBS洗2次，每孔加2mL含4%血清培养基，于0h、24h、48h观察拍照。

1.2.8 Transwell迁移及侵袭实验 Transwell迁移实验：将转染稳定的两组HeLa细胞胰酶消化离心，更换为无血清培养基后计数，将200μL无血清培养基中的105个细胞加至小室的上部，下腔室填充有10%FBS的相应培养基600μL，37℃、5%CO2孵育20h。PBS轻洗两遍，甲醇固定细胞30min，用棉签轻柔擦拭掉上室细胞，将下室细胞采用0.1%结晶紫溶液染色，染色15min，PBS洗涤3次，在显微镜200倍视野下，分别取左上、左下、右上、右下以及中间五个视野，计算穿膜细胞数。Transwell侵袭实验：步骤与Transwell迁移实验类似，但接种细胞前需用Matrigel包被聚碳酸酯膜，其余步骤一致。

宫腔镜联合腹腔镜子宫肌瘤剔除术对患者血清炎性因子及生活质量的影响………………………………………………………………………… 陆海英，等(12):1457

2 结 果

2.1 EXOSC4在宫颈癌组织与宫颈癌细胞中的表达及预后情况 根据GEPIA网站的分析，306例包括宫颈鳞癌与宫颈腺癌在内的宫颈癌样本与13例正常宫颈组织样本进行比较，发现EXOSC4在宫颈癌中高表达(P<0.05)(图1A)，并且高表达EXOSC4的患者预后较差(P<0.05)(图1B)。Western blot检测结果显示，宫颈癌组织中EXOSC4表达水平明显高于癌旁组织(P<0.01)(图1C、D)。与SiHa、HCC94宫颈癌细胞系相比，EXOSC4在HeLa细胞中表达最高(P<0.01)(图1E、F)，因此后续实验选用HeLa细胞进行。

图1 EXOSC4在宫颈癌组织中与细胞中的表达及预后情况A：基于GEPIA数据库分析EXOSC4在宫颈癌组织与正常宫颈组织中的表达水平；B：基于GEPIA数据库比较低EXOSC4表达水平和高EXOSC4表达水平患者的总生存期；C、D：Western blot检测EXOSC4在宫颈癌组织与癌旁组织中的表达水平(T:宫颈癌组织，P:癌旁组织)；E、F：EXOSC4在宫颈癌细胞系中的表达；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 shEXOSC4成功抑制HeLa细胞中EXOSC4的表达 转染慢病毒并经嘌呤霉素筛选后，qRT-PCR结果显示,与shNC组相比，shEXOSC4组细胞中EXOSC4 mRNA表达量显著降低(P<0.001)(图2A)。Western blot检测结果显示，与shNC组相比,shEXOSC4组中蛋白表达水平明显下调,差异有统计学意义(P<0.01)(图2B、C)。

2.3 下调EXOSC4抑制HeLa细胞的增殖能力并影响细胞周期 通过CCK-8实验和克隆形成实验检测各组的增殖能力，绘制细胞生长曲线后，发现下调EXOSC4抑制HeLa细胞的增殖(图3A)(P<0.001)；克隆形成实验发现shEXOSC4组细胞克隆数明显减少(图3B)(P<0.001)。流式细胞仪分析结果显示，与shNC组相比,shEXOSC4组在G1/G0期细胞百分比较高,但S期细胞百分比较低(图3C)(P<0.001)。这表明，在HeLa细胞中，下调EXOSC4可在G1/G0期阻滞细胞周期,进而影响细胞增殖。

2.4 下调EXOSC4抑制HeLa细胞的迁移和侵袭能力并促进细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)改变 在细胞划痕实验中，下调EXOSC4的HeLa细胞(shEXOSC4)迁移距离较对照组(shNC)细胞明显降低(P<0.001)(图4A)。细胞Transwell迁移实验中,shEXOSC4组的穿膜细胞数、侵袭细胞数明显低于shNC组(P<0.001)(图4B、C)。Western blot实验发现,下调EXOSC4可抑制HeLa细胞中间质表型标记物N-cadherin、Vimentin的表达而促进上皮表型标记物E-cadherin的表达(P<0.05)(图4D、E)。

2.5 下调EXOSC4表达对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的影响 Western blot实验结果显示，与shNC组相比,shEXOSC4组β-catenin、c-myc和cyclinD1蛋白的表达水平明显降低(图5A、B，P<0.01)。这表明EXOSC4可能通过Wnt/β-catenin通路影响宫颈癌细胞HeLa的增殖、迁移和侵袭。

图2 shRNA转染后对HeLa细胞中EXOSC4表达的影响A：实时荧光定量PCR检测；B、C：Western blot检测;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

图3 下调EXOSC4对HeLa细胞的增殖能力和细胞周期的影响A：CCK8增殖实验结果；B：细胞平板克隆形成实验结果；C：流式细胞术检测下调EXOSC4对HeLa细胞周期的影响;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

图4 下调EXOSC4对HeLa细胞的迁移和侵袭能力和EMT相关蛋白的影响A：细胞划痕实验结果；B：Transwell细胞迁移实验结果；C：Transwell细胞侵袭实验结果；D、E：Western blot检测EMT相关分子(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)表达结果;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 讨 论

宫颈癌是一个全球性的健康问题，每年约有50万例宫颈癌新发病例，而约40万例发生在发展中国家，严重威胁女性的生命健康[1]。宫颈癌传统的治疗方式为手术及放化疗，但是部分宫颈癌患者由于转移或复发，传统治疗方式对于提高患者生存期的效果不佳[9]。这使得精准治疗、靶向治疗在宫颈癌的治疗中有了一席之地，并且从分子水平上寻找用于宫颈癌治疗的新治疗靶标已经显示出良好的应用前景[10-11]。EXOSC4作为外泌体组成成分，生理功能主要在于参与外泌体的稳定和RNA的降解[12]。目前对于EXOSC4在肿瘤中的作用鲜有报道，少许研究发现该分子能在结直肠癌、肝癌、乳腺癌中有抗肿瘤的作用[7,13-14]。目前EXOSC4与宫颈癌的关系并无相关报道，本研究首次揭示了EXOSC4在宫颈癌发生发展中的作用，为宫颈癌的诊断与治疗提供了新的靶点。

本研究中EXOSC4在宫颈癌中高表达，这提示EXOSC4异常表达与宫颈癌的发生、发展密切相关；下调EXOSC4表达后，宫颈癌细胞的增殖能力明显下降；EXOSC4诱导从G0/G1期到S期的细胞周期停滞。细胞周期是一个复杂的过程，涉及许多调节蛋白，在不同的阶段，不同的细胞周期相关蛋白表达也会发生不同变化[15]。本研究结果表明，EXOSC4下调可抑制细胞周期相关分子cyclin D1表达下调，该分子促使细胞从G1期向S期转变，这提示EXOSC4可通过阻滞细胞周期而抑制宫颈癌细胞的增殖能力。

本研究发现，下调EXOSC4表达后宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力明显受到抑制，并导致EMT。肿瘤转移是一个多阶段的过程，包括黏附、迁移和侵袭[16]。在这个过程中，钙黏着蛋白(CDHs)作为细胞-细胞黏附分子的一个大家族，可动态调节黏附接触，从而影响肿瘤的侵袭和转移，如CDHs的成员E-cadherin的膜染色减少与宫颈癌的分级显著相关[17]，甚至在宫颈癌的癌前病变分级(CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ)中均发现E-cadherin表达下降[18]。另一个重要的CDHs成员是N-cadherin，但其与另一间充质标记物Vimentin一致，在宫颈鳞癌及较高的分级中表达更高，并与淋巴结转移相关[19]。在许多癌症中，EMT会被异常激活，是癌症高度转移和侵袭性的部分原因[20]。本研究证明，在下调EXOSC4的宫颈癌细胞中，EMT相关蛋白E-cadherin表达增加,N-cadherin、Vimentin表达明显减少，这表明EXOSC4是宫颈癌EMT的一个正向调节分子，为EMT通路可能成为防止肿瘤转移的靶点增添了依据。

在许多恶性肿瘤中，靶向Wnt/β-catenin途径都被认为是一个有价值的治疗选择[21]。Wnt/β-catenin途径和EMT相关蛋白转换之间的关联已得到很好的研究，如在非小细胞肺癌中，FOXP3通过激活Wnt/β-catenin途径诱导EMT转换，促进肿瘤生长和转移[22]。β-catenin是经典Wnt信号传导的核心，可促进各种基因(如c-myc和cyclin D1)的转录，从而抑制宫颈癌的增殖、迁移和侵袭[23-24]。与这些研究一致，本研究发现EXOSC4的沉默显著下调了HeLa细胞中β-catenin、c-myc和cyclin D1的表达。表明EXOSC4对宫颈癌细胞中Wnt/β-catenin信号的激活具有积极的调节作用。Zha等[25]研究发现，β-catenin下调抑制S100A9诱导的宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭，提示阻断Wnt/β-catenin信号可能抑制EXOSC4造成的宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。然而，EXOSC4对宫颈癌中Wnt/β-catenin信号转导的具体作用机制仍需进一步研究。

综上所述，EXOSC4是宫颈癌发生发展中的一个促癌因子，参与了宫颈癌细胞的增殖、迁移及侵袭。靶向抑制EXOSC4有望成为宫颈癌治疗的新手段，值得进一步深入研究。