樱桃根癌病病原菌鉴定及防治药剂筛选

田小曼， 李朝红

(1.杨凌职业技术学院，陕西 杨凌 712100； 2.汉中职业技术学院，陕西 汉中 723002)

0 引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试药剂 0.3%四霉素AS(辽宁微科生物工程有限公司)，80%乙蒜素EC(武汉三农科技开发有限公司)，72%农用链霉素WP(成都普惠生物工程有限公司)，46.1%可杀得叁千WG(美国杜邦公司)，80%多菌灵WP(陕西美邦农药有限公司)，75%百菌清WP(陕西恒田化工有限公司)，喜嘉旺人工树皮(陕西喜嘉旺生物科技有限责任公司)，极能植皮专家(陕西塞恩农业科技股份有限公司)。

1.1.2 接种材料 番茄植株：将毛粉802的番茄种子用0.5% NaClO表面消毒后投入55℃的水中进行温汤浸种，播种于经过处理的苗床土壤(自然土和基质土以1∶1的比例混匀，并灭菌)中，番茄苗2叶时移栽，每盆1株，45～50 d后接种处理。胡萝卜片：将新鲜胡萝卜切成厚度为1cm的圆片待用。

1.1.3 培养基 MW培养基：甘露醇10 g、0.1%生物素0.1 mL、KH2PO40.3 g、Fe-EDTA 2 mL、NaNO35 g、0.1%结晶紫2 mL、NaCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.1g，加水至1 000 mL。LB培养基：胰蛋白胨10 g、酵母抽提物5 g、NaCl 10 g，加水至1 000 mL。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g、琼脂 2 g，pH 7.0～7.2，加水至100 mL。3种培养基分别按要求制备及灭菌。

1.1.4 试剂盒 蛋白酶K、DNA提取试剂盒(EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit)、胶回收试剂盒、2×Taq PCR MasterMix及2×Mix(Promegar)，均购自武汉昆泰锐公司。

1.2 方法

1.2.1 病情调查 于2014年11月和2015年7月对西安市灞桥区狄寨村不同种植年限的樱桃园(每个种植年限随即挑取3个果园)进行樱桃根癌病抽样调查，每个樱桃园随机调查50株樱桃树。查看树势、观察树干、枝条是否有癌肿、虫伤及流胶情况，对树势衰弱的植株进行刨根调查，观察根部有无肿瘤、肿瘤数量、大小情况。根据调查结果计算发病率和病情指数。

病情分级：根据樱桃树的树势和枝条、根部瘤肿情况，采用4级分级标准[4]。

学生没有摇臂摄像机、滑动导轨等完善的专业设备，多数采用手持式拍摄，虽然灵活方便、角度多变，但稳定性要求较高。在后期剪辑中，可以利用会声会影滤镜，消除摇晃改善画质。也有的学生架设在三脚架上拍摄，拍摄的画面固定，一镜到底，枯燥单调。观众观看视频时，一般在3-5s的镜头画面之后，视觉兴趣就开始下降。因此在后期剪辑时，通常需要利用软件的修剪、分割等功能，根据景别的不同调整画面的长度，穿插不同类型的镜头。除此之外，还可以利用会声会影，模拟镜头的运动、速度、技巧变化，延续和保持观众的视觉兴趣。

发病率=调查病株数/调查总株数×100%

病情指数=[Σ(各级病株数×相应病级值)/(调查总株数×最高代表级值)]×100

1.2.2 菌株分离 采集发病严重植株枝条上的肿瘤、30 cm深处病株根部的肿瘤及肿瘤根部土壤，置于塑封袋保湿，冰箱-4℃保存，以备分离。

利用组织分离法进行菌株分离[5]。首先冲洗枝条和根部瘤体，刮除瘤体表面老化皮层，用灭菌解剖刀切取1 g新鲜、幼嫩瘤体，用无菌水冲洗干净瘤体表面，浸泡在8%次氯酸钠溶液中3 min，转入75%酒精溶液浸泡30 s，取出后无菌水清洗3次。将消毒处理过的瘤体放置于研钵中研磨捣碎，加入9 mL无菌水静置浸渍5 min，得到浓度为10-1悬浊液，再利用9 mL的无菌水依次稀释成10-2、10-3、10-4、10-5的悬浊液。称取根际土样10 g，在火焰旁加入盛有90 mL无菌水(内有30～40粒玻璃珠)的三角瓶中，置振荡机上振荡20 min，即得10-1浓度的土壤悬液。再依次稀释成10-2、10-3、10-4、10-5的悬浊液。

分别取组织分离和土壤分离的不同浓度的菌悬液100 μL，采用涂布或划线法接种在MW培养基和牛肉膏蛋白胨培养基平板上，28℃培养箱培养3～5 d，待出现菌落后，采用平板划线法把不同菌落特征的菌株纯化至平板上只出现1种菌落，即为纯化菌株，置于4℃冰箱保存。

1.2.3 菌株致病性测定 挑取纯化菌株涂抹接种于刺伤处理过的胡萝片上，圆盘置于盛有无菌滤纸的培养皿内，滤纸下垫有无菌水浸湿的棉球保湿，置于28℃条件培养，接种后每隔1 d观察和记录接种胡萝片的发病状况。3次重复，以无菌水接种作为对照。另外接种番茄植株考察菌株致病性，番茄植株接种时，先用75%酒精棉球擦拭番茄主茎，用无菌针轻刺接种部位。用无菌棉蘸取经LB摇培24 h的细菌悬浮液包裹在刺伤处48 h后取下，置于28℃条件培养，以无菌棉蘸取灭菌LB接种在刺伤处作为对照，3次重复。接种后每隔1 d观察和记录接种部位是否有隆起、肿大或是否肿瘤生成。若接种部位出现明显发病症状的，采用组织分离法分离发病部位菌株是否为接种菌株。

1.2.4 菌株生理生化鉴定和16S rDNA序列分析

1) 生理生化鉴定。参考伯杰细菌鉴定手册[6]和樱桃冠瘿病病原的分离与鉴定[7]中的生物型病原菌不同表现指标对菌株进行鉴定，包括革兰氏染色、3-酮基乳糖检测、耐盐性生长、35℃生长、Schroth培养基、Kerry & Brisbane培养基、氮源利用、丙二酸盐产碱、乙醇产酸和柠檬酸盐利用测验等。

2)16S rDNA序列分析。提取致病菌株的总DNA，使用通用引物(27F，1492R,正向5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)进行PCR扩增。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收片段长度在1 500 bp左右的条带，送至武汉昆泰锐公司进行测序。获得的序列用NCBI文库进行BLAST比对，寻找同源性较高的序列。采用MEGA 5.0软件中的邻接法构建菌株与其他相近菌株之间的进化树。

1.2.5 皿内抑菌活性测定 以分离的根癌土壤杆菌菌株DZ08为靶标，选取生产上常用的杀菌剂进行皿内抑菌活性测定。采用滤纸片抑菌圈法[8]将供试药剂稀释成200倍、400倍、800倍、1 000倍、1 200倍和1 600倍稀释液，分别吸取7 μL不同稀释液的药剂浸湿已灭菌、直径6 mm的圆形滤纸片，在无菌状态下自然风干后备用。吸取0.2 mL的DZ08菌悬液加入到无菌培养皿中，倒入已融化、温度50℃左右的LB培养基15 mL，待培养基凝固后，用无菌镊子夹取含药滤纸片平铺于含菌平板上，每皿放3片，每个不同浓度药剂3次重复，以无菌水作对照。于4℃条件下放置6～8 h，使滤纸片里的药剂能扩散和渗透均匀，再放于培养箱中28℃培养48～72 h，观察抑菌圈情况，用十字交叉法测量滤纸片周围的抑菌圈直径，以抑菌圈直径为依据，计算抑菌率、不同药剂的毒力回归方程、相关系数和EC50值。

1.2.6 田间药剂防治试验 根据试验结果，选择抑菌活性较好的药剂及适宜浓度于陕西省西安市灞桥区狄寨村开展田间药效试验。随机选择发病树体，彻底刮除枝干上的肿瘤后，在刮除部位及其外延分别充分涂抹筛选出的抑菌活性较好的药剂，待第1次涂抹的药剂稍干后再涂抹2～3次，干后再分别涂抹植物调节剂喜嘉旺人工树皮和极能植皮专家。每处理3棵树，每棵树选择6个刮除部位，3次重复。以病斑刮除后仅涂抹喜嘉旺人工树皮或极能植皮专家为对照。

1.3 数据处理

采用SPSS 22.0软件进行数据统计，用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 发病情况

从表1看出，树龄2 a的樱桃根癌病不发病，但随着树龄的增长发病率呈上升趋势，树龄超过10 a时发病率达100%，病情指数达80.67。患病树体不仅在根部形成直径2～5 cm的肿瘤，在枝干上也形成直径1～10 cm大小不等、形如花椰菜状的肿瘤。发病严重的树体肿瘤遍布枝干，将主干围成一圈，主干表面因肿瘤过多而发生龟裂，皮层裂开，呈黑褐色。

2.2 菌株分离与致病性测定

将从樱桃枝干和根部瘤体以及根际土壤进行常规组织分离获得的菌株分离纯化，根据其在牛肉膏蛋白胨培养基和MW培养基上的培养性状，共获得15株菌落形态圆形、偏白色、中间突起、有光泽、粘稠、边缘整齐的细菌菌落。其中，从根部瘤体分离出6株(DZ01、DZ02、DZ03、DZ04、DZ05、DZ06)，从土壤中分离出5株(DZ07、DZ08、DZ09、DZ10、DZ11)，枝条上分离出4株(DZ12、DZ13、DZ14、DZ15)。15株菌的菌落形态与土壤农杆菌菌落形态相似。

2.3 菌株的致病性

从图1看出，将分离得到的15个菌株刺伤接种于胡萝片上，仅菌株DZ08在接种8 d后，接种部位出现明显的过度增生现象，其余接种菌株在圆盘上无明显增生或导致接种部位隆起、腐烂现象。将分离得到的15个菌株刺伤接种于消毒的番茄茎部，也仅有菌株DZ08在接种10 d后于刺伤处出现细小突起，对照和接种其他菌株的番茄茎部伤口愈合，无突起生成。说明分离的15个菌株中仅菌株DZ08具有致病性。

注：a为胡萝卜清水对照，b为接种菌株DZ08，c为番茄茎部清水对照，d为接种菌株DZ08。

利用接种发病的番茄植株茎部出现的瘤体进行组织分离，获得的菌株与接种菌株在菌落形态、显微镜下镜检形态表现一致，从而证明菌株DZ08是根癌病的致病菌。

2.4 致病菌株的生理生化和分子生物学鉴定

2.4.1 生理生化鉴定 对致病性菌株DZ08进行生理生化鉴定结果(表2)表明，菌株DZ08的各个指标与根癌农杆菌生物I型的反应结果一致，由此判定致病性菌株DZ08是生物I型。

2.4.2 分子生物学鉴定 提取DZ08菌株的DNA，用引物进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳得到1 500 bp左右的条带，切胶回收后测序，获得长度1 100～1 200 bp的序列，在Genbank做BLAST比对分析，以此为依据判断菌株种类和近源种并建立系统发育树(图2)，可知菌株DZ08为土壤杆菌属(Agrobacteriumtumefaciens)(相似性高于98%)。

2.5 菌株的皿内抑菌效果

从表3看出，80%乙蒜素、0.3%四霉素、72%农用链霉素、多菌灵∶百菌清=1∶5及46%可杀得叁千5种药剂中，80%乙蒜素和0.3%四霉素的不同浓度稀释液都对土壤农杆菌表现出较强的抑制效果，抑菌圈直径分别为3.7～29.3 mm和1.6～23.7 mm，乙蒜素的抑菌效果强于四霉素；72%农用链霉素1200倍液、1600倍液及46%可杀得叁千和多菌灵+百菌清组合的1 000倍液、1 200倍液、1 600倍液无抑菌效果。说明，0.3%四霉素、80%乙蒜素和72%农用链霉素的抑菌效果较好，根据3种药剂对土壤农杆菌的EC50值(表4)，樱桃根癌病病原菌的抑菌效果依次为0.3%四霉素>80%乙蒜素>72%农用链霉素。

表3 不同药剂处理根癌农杆菌的抑菌圈直径

表4 3种药剂对根癌农杆菌的回归方程及EC50

2.6 田间药剂防治效果

从图4看出，不同药剂与植物调节剂喜嘉旺人工树皮组合涂抹刮除樱桃根癌病肿瘤部位的病斑愈合率为A1B1>A2B1>A3B1>A4B1>A5B1，不同药剂与植物调节剂极能植皮专家组合涂抹的效果为A1B2>A2B2>A5B2>A3B2>A4B2，各组合的病斑愈合率均高于单独涂抹植物调节剂喜嘉旺人工树皮组合和植物调节剂极能植皮专家。说明，乙蒜素和四霉素与2种植物调节剂组合的防效较好，其病斑平均愈合率分别为83.56%和77.2%。

注：A1～A5分别为乙蒜素(1 000倍)、四霉素(800倍)、多菌灵+百菌清(500倍)、农用链霉素(500倍)、可杀得叁千(500倍)，B1、B2分别为喜嘉旺人工树皮和极能植皮专家。

3 讨论

对灞桥区狄寨村樱桃根癌病的田间调查表明，该病发生严重，特别是树龄3 a以上的樱桃树，而且由于刚开始发病在枝干上症状并不明显，容易被忽视，到枝条上出现出明显病状时，根癌病已较严重，防治困难。另外，根癌病菌主要从伤口入侵，可以在患病组织和土壤中越冬，所以在防治中，应该贯彻“预防为主，综合防治”的指导方针，把栽培技术和抗性品种放在首位，建设新果园前彻底清理和消毒果园，施足底肥，减少病虫害的发生机率；加强苗木检疫，剔除有病状的幼苗，种植之前对苗木严格消毒，尽量延缓病害的发生和发展。同时，研制和筛选对根癌病有效的药剂也能在一定程度上控制病害的进一步扩展，减缓植株的衰弱，延长树龄，保持樱桃产量，为果农增加经济效益[9]。

从灞桥区狄寨村的樱桃冠瘿病病样本中共分离出15个菌株，仅菌株DZ08为樱桃根癌病的致病菌，生理生化鉴定为生物I型。刘保友等[10]从烟台大樱桃根癌病样本中分离出23株致病菌株，其中16株为生物II型，其余为生物I型。王志龙等[11]从浙江宁波樱花根癌病中分离得10株致病菌，7株为生物II型，3株为生物I型。冯瑛等[7]从灞桥区冠瘿病根部瘤体中分离出1株根癌农杆菌生物I型菌株，是樱桃枝条和根产生冠瘿瘤的致病菌。生物I和II型都有致病作用，但因不同地区环境条件差异，病原菌的生物型可能不一样，特别是优势菌株生物型可能不同。

乙蒜素是一种高效广谱仿生杀菌剂，植物仿生农药，其作用机理是与菌体内含硫基的物质作用，影响菌体的正常代谢，从而达到抑菌的效果[12]。乙蒜素兼具植物生长调节作用，能促进萌芽、提高发芽率、增加产量和改善品质[13]。本研究结果表明，乙蒜素对于根癌农杆菌有较好的抑制效果，与乙蒜素对根癌病病原菌有抑菌效果[14]研究结论一致。四霉素又称梧宁霉素，是放线菌链霉菌属中的不吸水链霉菌梧州亚种(Streptomycesahygroscopicuswuzhouensis subspl1371)的发酵代谢物，是一种广谱的生物杀菌剂。四霉素在发酵过程中可形成多种能被作物吸收利用的微量元素，有提高植物组织愈伤能力、诱导防御酶系活性升高而增强作物抗病能力和优化作物品质[15-16]等功效。目前未见四霉素防治根癌病的报道。研究结果表明，四霉素皿内抑菌和田间防治均有较好的效果，可以将四霉素更多地应用于田间防治中。

植物生长调节剂喜嘉旺人工树皮和极能植皮专家采用仿人类手术植皮再生的原理，对保护伤口、促进伤口愈合有特效。所以在刮除病斑、杀菌剂涂抹后辅之以调节剂涂抹伤口，能够使伤口更好更快地愈合，恢复树势，避免病原菌的再次侵染。在喜嘉旺人工树皮和极能植皮专家种涂抹剂的处理中，乙蒜素和四霉素都表现出最好的效果，两者均适合与药剂复配使用。

4 结论

对西安市灞桥区樱桃根癌病田间发生情况调查发现，该病发生严重，而且随着种植年限增加，发病率呈上升趋势，老树发病率100%。通过组织分离法分离得到病原菌菌株15株，经生理生化鉴定、分子生物学鉴定和致病性鉴定，具有致病性的菌株为DZ08，是该地区根癌病的主要病原菌，经生理生化反应鉴定为生物Ⅰ型。通过皿内抑菌试验筛选出针对根癌病的靶标药剂为80%乙蒜素、0.3%四霉素、72%农用链霉素、多菌灵∶百菌清=1∶5及46%可杀得叁千5种，以0.3%四霉素、80%乙蒜素和72%农用链霉素的防治效果较好。将5种药剂进行大田药效试验结果表明，5种药剂涂抹病斑都有一定的治愈效果，其中以乙蒜素、四霉素与植物调节剂喜嘉旺人工树皮和极能植皮专家组合的效果较好，病斑平均愈合率分别为83.56%和77.2%。