雌二醇对帕金森病细胞损伤模型中PC12细胞Cav1.3基因表达的影响

何玲 犹秋香 陈光梅 王启春 江显萍 吴立新 熊劲 贺歆彦

(1黔南州人民医院老年科，贵州 都匀 558000；2重庆医科大学附属第三医院神经疾病中心；3黔南州人民医院神经内科)

帕金森病(PD)是一种在老年人群中较为常见的神经系统疾病〔1〕。有调查研究显示我国65岁以上人群患有PD的概率为1.7%，虽然PD有遗传效应但绝大多数的疾病患者都是散发病例〔2〕。PD患病因脑中的脑黑质多巴胺能神经元出现变性死亡，从而导致黑质多巴胺的含量减少而患病〔3〕。但导致黑质多巴胺能神经元死亡的原因仍尚未清楚，目前主要影响因素包括机体老化、遗传因素、环境因素、氧化应激等〔4〕。雌二醇是一种甾体雌激素，雌激素对于中枢神经系统具有一定的保护作用，有研究显示老年人体患PD与其雌性激素分泌量的减少有着一定的关系，但是将雌激素用于临床治疗却有着较大的争议〔5〕。本文拟探讨雌二醇对PD病细胞损伤模型中PC12细胞Cav1.3基因的表达影响，为雌激素与PD之间的关系研究提供参考。

1 材料与方法

1.1材料 主要试剂：DMEM高糖培养基、6-羟多巴胺(6-OHDA)、17β-雌二醇、胎牛血清、马血清、磷酸盐缓冲液(PBS)、裂解液等。主要仪器：离心机、各类实验用玻璃仪器、电泳机等。

1.2PC12细胞的培养 用DMEM完全培养基培养PC12细胞株，其中DMEM完全培养基的组成为5%的胎牛血清、5%的马血清(灭活)、青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 μg/ml)，传代接种时用2×105/ml的细胞密度悬液进行，接种在25 cm2细胞培养瓶中。细胞培养的环境设置为温度37℃、CO2浓度为5%、湿度为饱和湿度，每培养2～3 d进行1次换液，培养4～6 d后进行1次传代。

1.3实验分组 根据实验要求一共分为3个组，分别为空白对照组，6-OHDA作用组和雌二醇干预组，雌二醇干预组又设置不同浓度的雌二醇干预亚组。空白组为在不含有6-OHDA和17β-雌二醇的DMEM完全培养基上进行培养PC12细胞；6-OHDA作用组为在含有6-OHDA的DMEM完全培养基上进行培养PC12细胞，其中6-OHDA的浓度为50 μmol/L；雌二醇干预组为在含有6-OHDA和17β-雌二醇的DMEM完全培养基上进行培养PC12细胞，其中6-OHDA的浓度与6-OHDA作用组相同，17β-雌二醇的浓度每个亚组的都不同，分别为10-10mol/L，10-9mol/L，10-8mol/L，10-7mol/L，10-6mol/L。所有的培养基都是接种相同浓度、相同规格的PC12细胞悬浮液进行培养。

1.4评价方法 (1)使用MTT法检测细胞活性，以空白对照组的细胞活性为标准，将其细胞MTT还原率定为100，其他组的细胞活性与空白对照组进行比较，观察各组在细胞活性上的差别。(2)使用Western印迹法检测Cav1.3基因的蛋白表达，首先进行总蛋白的提取：①将PC12细胞从培养基中取出，然后将培养液倒掉，使用PBS将提取出来的PC12细胞清洗两遍，清洗完后将其放置于冰上，加入适量的裂解液，保证裂解液均匀的覆盖在细胞的表明，静置5 min；②使用移液枪将细胞脱离到离心管中，将离心管放在冰上震荡10 min，10 min后放入离心机中进行离心，离心设置为12 000 r/min，离心温度为4℃，离心时长为15 min，离心结束后取上层清液；③使用考马斯亮蓝法测定蛋白的总浓度，在测出浓度后将其均一化浓度为3.75 mg/μl。其次用Western印迹法检测Cav1.3基因的蛋白表达：①根据实验要求配置浓度为12%的分离胶，在分离胶凝固后在配置浓度为4%的浓缩胶，在7 min后拔梳子；②将配置好的蛋白样品加入到浓缩胶中，然后开始进行电泳，电泳的设置为50 V，1 h，100 V，2 h；③在电泳完成后将条件改变为90 V，1.5 h，将蛋白样本转移到硝酸纤维素(NC)膜上；④在转移完成后使用稀释液封闭1.5 h，在封闭过程中要将起的泡泡赶干净。在封闭时间达到后向其中加入已经稀释好的一抗体溶液，将样品放到摇床上进行过夜，温度设置为4℃；⑤第2天，将样品中的NC膜取下，使用PBS-T溶液洗涤3次，在洗涤完成后加入浓度为1∶5 000的二抗溶液，将其混合，混合时要在避光的条件下进行，充分混合均匀后取出NC再使用PBS-T溶液洗涤4次；⑥对蛋白样品进行扫描，将扫描结果与β-actin灰度进行比较，以此来确定目标蛋白的含量。每种分组3次平均值为最终结果。

1.5统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1不同组PC12细胞活性比较 6-OHDA作用组PC12细胞活性显著低于空白对照组(P<0.05)；各雌二醇干预组中的PC12细胞的细胞活性与空白对照组比较均显著下降，但显著高于6-OHDA作用组(P<0.05)；且呈浓度依赖性(P<0.05)。见表1、图1。

表1 各组PC12细胞活性及Cav1.3基因表达蛋白含量对比

A～G：空白组，6-OHDA作用组;雌二醇干预组(10-10mol/L)；雌二醇干预组(10-9mol/L)；雌二醇干预组(10-8mol/L);雌二醇干预组(10-7mol/L)；雌二醇干预组(10-6 mol/L)图1 细胞PC12细胞活性观察(MTT，×400)

2.2不同组细胞的Cav1.3基因表达蛋白含量比较 6-OHDA作用组Cav1.3基因相对蛋白含量显著高于空白对照组(P<0.05)；雌二醇干预组中的PC12细胞的Cav1.3基因表达蛋白的含量显著高于空白对照组，但显著低于6-OHDA作用组(P<0.05)，且呈浓度依赖性(P<0.05)，见表1、图2。

1～3为平行样图2 Cav1.3基因蛋白表达

3 讨 论

PD的临床症状主要表现为静止性震颤、运动缓慢、肌肉僵直、无法以正常姿势行走，同时PD患者还可能伴有抑郁、便秘和睡眠障碍等非运动型的症状〔6〕。对于PD的诊断主要是通过患者的病史，临床症状和行为特征进行判断，其他辅助性检查对于诊断结果影响不大〔7〕。对于PD的治疗主要是通过药物进行治疗，其中左旋多巴制剂是现在用于治疗PD的最有效的药物，还可以辅助以手术治疗、心理治疗、康复治疗等〔8〕。但是现在的治疗方法都只是对病情进行缓解，改善患者的临床症状，无法对PD进行根本上的治愈，也无法阻止病情的持续发展〔9〕。

雌二醇是一种甾体雌激素，这种激素有两种类型分别为α-雌二醇和β-雌二醇，本实验使用的就是β-雌二醇。雌二醇是一种生理作用较强的激素，由于其有很强的性激素作用，所以又将其称为“动情素”和“求偶素”〔10〕。雌激素能促使细胞合成DNA、RNA和相应组织内各种不同的蛋白质，在临床疾病的治疗中有着一定的应用〔11〕。主要是用于补充患者的雌激素不足、治疗转移性乳腺癌、治疗晚期前列腺癌、防治骨质疏松、治疗痤疮、白细胞减少症、用作事后避孕药和退奶等〔12〕。6-OHDA是一种神经毒性物质，可以对神经细胞产生损伤，虽然人体脑中也会产生6-OHDA，但是产生的量很少，对神经细胞的毒性作用很小，但是在一定生理作用下可能会产生大量的6-OHDA，从而对神经细胞产生严重的损伤。有研究显示6-OHDA的含量过高可能是导致黑质多巴胺能神经元细胞变性死亡的原因之一〔13〕。PC12细胞是一个常用于相关实验的神经细胞株，其来源为于一种可移植的鼠嗜铬细胞瘤，这种细胞有明显的神经细胞反应，常被用于体外神经细胞模型，进行相关的药物实验，以此来探讨相关药物对于神经细胞的作用原理和效果〔14〕。

L型钙通道作为一种类型钙通道，对电压有极强的依赖性，故又将其视作一种电压依赖性钙通道的类型钙通道，这个通道可以通过控制钙离子的流动形成L型电流，在神经细胞中有着重要作用〔15〕。哺乳动物的大脑主要表达Cav1.2和Cav1.3两种LTCC亚型。Cav1.3介导的细胞内钙超载导致了黑质致密部多巴胺能神经元的病理改变，且该作用发生在疾病早期。其对神经细胞中的L型钙离子通道有着重要的影响作用，通过检测Cav1.3基因的表达情况可以来判断神经细胞的活跃程度和损伤状况。雌激素除了控制人体的一些生殖行为和非生殖行为之外还对位于中脑的黑质多巴胺能神经元有着调节作用。有研究〔9〕显示雌激素的含量水平与PD的发病率有着一定的关联，雌激素可以激活中脑的黑质多巴胺能神经元细胞核内的受体，提高其抗凋零蛋白基因的表达以此来阻止中脑的黑质多巴胺能神经元的变性死亡，保护中脑的黑质多巴胺能神经元的效果，对PD起到治疗效果。

本实验显示空白对照组的PC12细胞中的Cav1.3基因表达蛋白的含量要低于6-OHDA作用组，造成这样的原因为6-OHDA是一种具有神经细胞毒性的物质，6-OHDA作用组的PC12细胞受到了6-OHDA的神经毒素作用受到了损伤，细胞内的代谢程度下降呈现坏死状态，导致Cav1.3基因的表达增加，会引起钙超载从而加重细胞的损伤。在检测中可以发现17β-雌二醇对PC细胞起到了保护作用，降低了6-OHDA对其的毒性效果，让细胞没有受到那么大的损伤，使得相关蛋白的含量要低于作用组，其作用原理为17β-雌二醇通过扩散作用进入到PC12细胞的细胞核内与细胞核类的相关受体产生结合发挥作用，提高增加神经细胞活性的相关基因进行表达，保护细胞不受6-OHDA的影响，不会影响Cav1.3基因的表达。17β-雌二醇的浓度越高对神经细胞的保护效果越好。

综上，雌二醇对PD细胞损伤模型中PC12细胞Cav1.3基因的表达有着积极的影响，雌二醇可通过保护PD细胞损伤模型中PC12细胞从而避免细胞中的Cav1.3基因表达过高，并且雌二醇的浓度与Cav1.3基因表达呈负相关， 6-OHDA制备PC12细胞损伤模型，在6-OHDA作用组中Cav1.3的表达增高；加了雌二醇保护后，增高的Cav1.3基因的表达量下降，期望为PD的治疗提供一定参考和思路。