锡叶藤化学成分及其对神经递质的影响

杨明辉， 刘志勇*， 关东升， 董 宁， 李 歌， 代 云

(1.河南省中医院，河南 郑州 450002；2.河南中医药大学，河南 郑州 450046)

锡叶藤Tetraceraasiatica(Lour.) Hoogland又称对角刺、酸铜子、对节刺、刺冻绿，是五桠果科锡叶藤属植物锡叶藤和毛叶锡叶藤的根[1]，多生长于海拔500～2 100 m的丘陵、灌丛、山地林中，主要分布地域为日本、朝鲜、越南、印度及中国的河南、湖北、广东、广西等地，具有收涩固脱、消肿止痛、固精益智的功效，用于久泻久痢、尿血便血、遗精遗尿、白带过多、子宫脱垂、脱肛、跌打肿痛等[2]，其主要化学成分包括黄酮类、有机酸类、苯醌类、木脂素类、生物碱类[3]，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、保肝、神经保护，提高免疫力等作用[4-5]。本实验对锡叶藤95%乙醇提取物进行分离，得到13个化合物，均为首次从该植物中分离得到，其中化合物1～3、7～9、11～13为首次从该属植物中发现。再测试所得化合物对神经递质(5-羟色胺、氨基丁酸、甘氨酸、谷氨酸)的影响，结果显示化合物1～2、7、11～12对神经递质有不同程度的改善。

1 材料

Triple-T5843型高分辨质谱仪(美国AB Sciex公司)；Bruker AV 400型核磁共振波谱仪(TMS内标，瑞士Bruker公司)；HT1217K型电子天平(瑞士Buchi公司)；Sephadex LH-20(德国Merck公司)；JF2615型旋转蒸发器(美国Pharmacia公司)；柱色谱硅胶(100～200、300～400目，青岛海洋化工厂)；PK-26型暗箱式紫外分析仪(美国Bio-Rad公司)；神经节苷脂(日本Olypms公司)； CO2培养箱(美国Thermo Scientific公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司)。提取分离所用溶剂均为分析纯。

锡叶藤采自河南省平顶山市，由平顶山学院夏西超教授鉴定为锡叶藤Tetraceraasiatica(Lour.) Hoogland 的根。

2 提取与分离

取干燥锡叶藤31.5 kg，加入95%乙醇回流提取3次(2、2、1 h)，合并提取液，减压回收溶剂，得锡叶藤浸膏3.8 kg。将上述浸膏超声溶于水中，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚萃取物(163.2 g，Fr.A)、二氯甲烷萃取物(116.3 g，Fr.B)、乙酸乙酯萃取物(115.6 g，Fr.C)、正丁醇萃取物(124.5 g，Fr.D)。取Fr.B，采用硅胶柱分离，以石油醚-丙酮(100∶0～0∶100)梯度洗脱，合并相似组分，得到9个组分(Fr.B1～Fr.B9)。取Fr.B3，采用硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯(80∶20～20∶80)梯度洗脱，得到12个组分(Fr.B3-1～Fr.B3-12)。Fr.B3-5经石油醚-丙酮(70∶30)分离，得化合物3(19 mg)、7(27 mg)；Fr.B3-7经结晶、重结晶，得化合物1(26 mg)；Fr.B3-9经Sephadex LH-20分离，以甲醇洗脱，得化合物4(24 mg)。取Fr.C，采用硅胶柱色谱分离，以石油醚-二氯甲烷(80∶20～20∶80)梯度洗脱，合并得到11个组分(Fr.C1～Fr.C11)。Fr.C2经硅胶柱分离，以石油醚-乙酸乙酯(70∶30～30∶70)梯度洗脱，得到10个组分(Fr.C2-1～Fr.C2-10)。Fr.C2-4经硅胶柱分离，以石油醚-丙酮(50∶50)洗脱，得化合物2(22 mg)、9(27 mg)；Fr.C2-6经Sephadex LH-20分离，以甲醇洗脱，得化合物5(34 mg)；Fr.C2-8经硅胶柱分离，以石油醚-乙酸乙酯(40∶60)洗脱，得化合物6(32 mg)、11(18 mg)。取Fr.C5，采用硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮(60∶40～40∶60)梯度洗脱，得到8个组分(Fr.C5-1～Fr.C5-8)。Fr.C5-3以石油醚-丙酮(50∶50)分离，得化合物8(28 mg)、13(23 mg)；Fr.C5-5经Sephadex LH-20分离，以甲醇洗脱，得化合物12(34 mg)。取Fr.D，采用硅胶柱分离，以二氯甲烷-正丁醇(90∶10～10∶90)梯度洗脱，合并相似成分，得到8个组分(Fr.D1～Fr.D8)。取Fr.D3，采用硅胶柱色谱分离，以丙酮-正丁醇(60∶40～40∶60)梯度洗脱，得到7个组分(Fr.D3-1～Fr.D3-7)。Fr.D3-5经硅胶柱分离，以乙酸乙酯-正丁醇(50∶50)洗脱，得化合物10(26 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：黄色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 356.1[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 6.81 (1H，d，J=12.0 Hz，H-2)，6.49 (1H，d，J=12.0 Hz，H-1)，4.39 (1H，d，J=8.2 Hz，H-9)，4.31 (1H，d，J=8.2 Hz，H-7)，3.96 (1H， m，H-6)，3.79 (3H，s，3-OCH3)，3.70 (3H，s，8-OCH3)，3.09 (1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，Ha-10)，3.05～2.83 (2H，m，Ha-5，Hb-10)，2.69 (1H，td，J=12.0，8.2 Hz，Ha-16)，2.71～2.56 (1H，m，Hb-16)，2.24(1H，d，J=12.0 Hz，Hb-5)，2.06 (1H，d，J=8.2 Hz，Ha-15)，1.92 (1H，td，J=8.2，2.2 Hz，Hb-15)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 120.4 (C-1)，109.8 (C-2)，148.2 (C-3)，147.3 (C-4)，36.8 (C-5)，69.2 (C-6)，67.3 (C-7)，147.2 (C-8)，47.3 (C-9)，37.2 (C-10)，130.6 (C-11)，124.1 (C-12)，40.3 (C-13)，129.4 (C-14)，39.2 (C-15)，40.8 (C-16)，56.9 (3-OCH3)，57.2 (8-OCH3)。以上数据与文献[6]基本一致，故鉴定为sinococuline。

化合物2：白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 484.2[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 7.51 (1H，d，J=12.0 Hz，H-7‴)，6.97 (1H，brs，H-2‴)，6.73 (1H，d，J=12.0 Hz，H-6‴)，6.54 (1H，d，J=12.0 Hz，H-5‴)，6.37 (2H，brs，H-2，5)，6.29 (1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-6)，6.09 (1H，d，J=12.0 Hz，H-8‴)，4.35 (1H，d，J=12.0 Hz，H-1′)，4.08 (1H，d，J=12.0 Hz，H-1″)，2.73(2H，m，H-7)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 131.5 (C-1)，118.7 (C-2)，146.2 (C-3)，144.5 (C-4)，117.1 (C-5)，121.3 (C-6)，36.2 (C-7)，69.8 (C-8)，100.3 (C-1′)，70.5(C-2′)，77.4 (C-3′)，66.3 (C-4′)，76.1 (C-5′)，68.2 (C-6′)，104.3 (C-1″)，73.1(C-2″)，76.9 (C-3″)，69.8 (C-4″)，76.4 (C-5″)，60.2 (C-6″)，125.7 (C-1‴)，115.3 (C-2‴)，146.1 (C-3‴)，151.2 (C-4‴)，117.5 (C-5‴)，122.3 (C-6‴)，145.6 (C-7‴)，114.1 (C-8‴)，167.2 (C-9‴)。以上数据与文献[7]基本一致，故鉴定为isolugrandoside。

化合物3：白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 273.1[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 6.23 (1H，d，J=8.2 Hz，H-13a)，5.52 (1H，d，J=8.2 Hz，H-13b)，4.19 (1H，m，H-8)，3.91 (1H，t，J=8.2 Hz，H-4)，0.87 (3H，d，J=8.2 Hz，H-14)，0.83 (3H，s，H-15)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 44.8 (C-1)，24.7 (C-2)，29.1 (C-3)，84.2 (C-4)，45.1 (C-5)，37.2 (C-6)，48.3 (C-7)，82.1 (C-8)，45.2 (C-9)，29.6 (C-10)，138.4 (C-11)，169.5 (C-12)，120.6 (C-13)，19.8 (C-14)，18.1 (C-15)。以上数据与文献[8]基本一致，故鉴定为2-desoxy-4-epi-pulchellin。

化合物4：白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 175.1[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 9.72 (1H，s，H-7)，7.41 (2H，dd，J=8.2，2.2 Hz，H-2，6)，7.04 (1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，4.03 (3H，s，4-OCH3)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 128.6 (C-1)，129.1 (C-2)，149.2 (C-3)，159.1 (C-4)，109.2 (C-5)，116.8 (C-6)，55.8 (4-OCH3)，193.1 (7-CHO)。以上数据与文献[9]基本一致，故鉴定为3-羟基对甲氧基苯甲醛。

化合物5：黄色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 169.3[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 9.49 (1H，d，J=8.2 Hz，H-9)，7.61 (1H，d，J=12.0 Hz，H-7)，7.19 (1H，d，J=8.2 Hz，H-2)，7.08 (1H，dd，J=8.2，2.2 Hz，H-6)，6.76 (1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.58 (1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-8)，3.92 (3H，s，3-OCH3)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 127.3 (C-1)，110.3 (C-2)，149.1 (C-3)，152.7 (C-4)，112.4 (C-5)，126.2 (C-6)，158.1 (C-7)，119.1 (C-8)，55.9 (3-OCH3)，195.7 (9-CHO)。以上数据与文献[10] 基本一致，故鉴定为3-甲氧基对羟基肉桂醛。

化合物6：白色粉末(丙酮)。ESI-MSm/z: 247.2[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 12.65 (1H，s，-OH)，6.41 (1H，d，J=12.0 Hz，H-6′)，5.96 (1H，d，J=12.0 Hz，H-4′)，4.03 (2H，s，2-CH2)，3.82 (3H，s，-OCH3)，2.71 (3H，s，2′-COCH3)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 169.8 (C-1)，39.7 (C-2)，135.9 (C-1′)，113.8 (C-2′)，159.7 (C-3′)，118.2 (C-4′)，158.1 (C-5′)，109.4 (C-6′)，51.3 (1-OCH3)，31.2 (2′-COCH3)。以上数据与文献[11]基本一致，故鉴定为2-乙酰基-3，5-二羟基-苯乙酸甲酯。

化合物7：黄色粉末(丙酮)。ESI-MSm/z: 339.1[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 11.93 (1H，s，5-OH)，7.12 (1H，d，J=12.0 Hz，H-2′)，7.05 (1H，d，J=12.0 Hz，H-5′)，6.91 (1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-6′)，6.08 (1H，d，J=8.2 Hz，H-8)，5.93 (1H，d，J=8.2 Hz，H-6)，5.51 (1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-2)，3.89 (3H，s，7-OCH3)，3.82 (3H，s，4′-OCH3)，3.19 (1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-3a)，2.82 (1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-3b)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 103.7 (C-1)，77.2 (C-2)，43.5 (C-3)，198.5 (C-4)，162.3 (C-5)，95.3 (C-6)，166.7 (C-7)，94.1 (C-8)，161.8 (C-9)，103.4 (C-10)，129.4 (C-1′)，112.4 (C-2′)，145.7 (C-3′)，148.2 (C-4′)，113.7 (C-5′)，118.2 (C-6′)，56.3 (4′-OCH3)，57.1 (7-OCH3)。以上数据与文献[12]基本一致，故鉴定为5，3′-dihydroxy-7，4′-dime-thoxyflavanone。

化合物8：白色粉末(丙酮)。ESI-MSm/z: 201.3[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 4.72 (1H，d，J=8.2 Hz，H-1′)，4.28 (1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-5′)，3.97 (1H，dq，J=12.0，8.2 Hz，H-2)，3.70 (1H，dq，J=8.2，2.2 Hz，H-1)，3.65 (1H，brd，J=11.3 Hz，H-3)，1.24 (3H，t，J=8.2 Hz，H-4′)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 64.9 (C-1)，16.8 (C-2)，104.9 (C-1′)，74.8 (C-2′)，79.1 (C-3′)，70.8 (C-4′)，66.8 (C-5′)。以上数据与文献[13]基本一致，故鉴定为ethyl β-D-xylopyranoside。

化合物9：黄白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 469.8[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 7.23 (2H，d，J=12.0 Hz，H-11，13)，6.98 (2H，d，J=12.0 Hz，H-10，14)，6.74 (1H，s，H-5)，6.58 (1H，s，H-5)，4.82 (1H，d，J=8.2 Hz，H-1′)，3.97 (1H，brs，H-1)，3.93～3.29 (6H，m，H-2′～6′)，3.76 (3H，s，12′-OCH3)，3.24～2.68 (6H，m，H-3，4，15)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 58.3 (C-1)，63.7 (C-2)，42.2 (C-3)，30.1 (C-4)，113.7 (C-5)，149.3 (C-6)，146.2 (C-7)，112.7 (C-8)，134.2 (C-9)，130.3 (C-10)，117.6 (C-11)，157.6 (C-12)，117.3 (C-13)，132.4 (C-14)，41.8 (C-15)，103.1 (C-1′)，74.8 (C-2′)，77.6 (C-3′)，72.2 (C-4′)，77.4 (C-5′)，63.1 (C-6′)，125.6 (C-4a)，129.3 (C-4b)，55.8 (12-OCH3)。以上数据与文献[14]基本一致，故鉴定为coclaurine 3-O-β-D-glucoside。

化合物10：白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 359.3[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 3.72 (1H，t，J=8.2 Hz，H-17a)，3.63 (1H，t，J=8.2 Hz，H-17b)，1.18 (3H，s，H-18)，1.09 (3H，s，H-20)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 39.7 (C-1)，18.8 (C-2)，38.2 (C-3)，44.1 (C-4)，57.4 (C-5)，21.8 (C-6)，42.3 (C-7)，45.2 (C-8)，56.3 (C-9)，40.2 (C-10)，19.3 (C-11)，25.4 (C-12)，44.8 (C-13)，36.5 (C-14)，53.4 (C-15)，82.3 (C-16)，66.1 (C-17)，30.2 (C-18)，181.3 (C-19)，16.1 (C-20)。以上数据与文献[15]基本一致，故鉴定为16α，17-dihydroxy-ent-kaura-19-oic acid。

化合物11：白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 399.7[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 5.13 (1H，s，H-14)，4.02 (1H，t，J=8.2 Hz，H-15)，3.91 (1H，t，J=8.2 Hz，H-16a)，3.79 (1H，m，H-2)，3.69 (1H，t，J=8.2 Hz，H-16b)，3.57 (1H，d，J=12.0 Hz，H-19a)，3.26 (1H，d，J=12.0 Hz，H-19b)，1.41 (3H，s，H-22)，1.30 (3H，s，H-23)，1.12 (3H，s，H-18)，0.91 (3H，s，H-17)，0.84 (3H，s，H-20)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 48.3 (C-1)，64.7 (C-2)，43.8 (C-3)，40.2 (C-4)，54.8 (C-5)，21.6 (C-6)，35.8 (C-7)，137.2 (C-8)，49.3 (C-9)，39.1 (C-10)，19.6 (C-11)，32.6 (C-12)，36.3 (C-13)，128.3 (C-14)，80.2 (C-15)，64.1 (C-16)，23.2 (C-17)，26.2 (C-18)，65.2 (C-19)，16.9 (C-20)，109.3 (C-21)，25.8 (C-22)，24.7 (C-23)。以上数据与文献[15]基本一致，故鉴定为isopropylidenkirenol。

化合物12：黄色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 504.9[M+Na]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 7.23 (1H，brs，H-6′)，7.02 (1H，s，H-2″)，6.73 (1H，brs，H-6″)，6.48 (1H，brs，H-5′)，6.47 (1H，d，J=12.0 Hz，H-5″)，5.82 (1H，brs，H-6)，5.57 (1H，brs，H-8)，5.51 (1H，brs，H-a)，4.76 (1H，d，J=12.0 Hz，H-2)，4.19 (1H，d，J=12.0 Hz，H-3)，3.67 (1H，m，H-γ)，3.61 (3H，s，3″-OCH3)，3.52 (1H，brs，H-β)，3.29 (1H，brs，H-β)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 105.6 (C-1″)，79.5 (C-2)，72.4 (C-3)，200.3 (C-4)，153.9 (C-5)，94.2 (C-6)，146.9 (C-7)，95.1 (C-8)，156.4 (C-9)，99.8 (C-10)，122.6 (C-1′)，115.3 (C-2′)，140.2 (C-3′)，136.9 (C-4′)，111.8 (C-5′)，100.2 (C-6′)，143.1 (C-1″)，105.3 (C-2″)，150.2 (C-3″)，145.3 (C-4″)，113.5 (C-5″)，120.2 (C-6″)，80.2 (C-a)，49.5 (C-β)，58.7 (C-γ)，56.1 (3″-OCH3)。以上数据与文献[16]基本一致，故鉴定为isosilychristin。

化合物13：白色粉末(丙酮)。ESI-MSm/z: 271.3[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 6.68 (1H，t，J=8.2 Hz，H-7)，6.31 (1H，d，J=8.2 Hz，H-8)，5.73 (1H，d，J=8.2 Hz，H-6)，4.08 (1H，s，H-1)，2.63 (3H，s，H-CH3)，2.32 (3H，s，H-CH3)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 67.2 (C-1)，65.3 (C-2)，69.3 (C-3)，195.8 (C-4)，163.9 (C-5)，116.1 (C-6)，137.2 (C-7)，118.4 (C-8)，111.7 (C-9)，143.2 (C-10)，29.2 (2-CH3)，16.3 (5-CH3)。以上数据与文献[17]基本一致，故鉴定为3-acetyl-2-methyl-1，5-dihydroxy-2，3-epoxynaphth-oquinol。

4 抗炎活性筛选

采用Griess法[18]检测化合物1～13对氯化钴诱导的PC12细胞中神经递质(5-羟色胺、氨基丁酸、甘氨酸、谷氨酸)的影响，以神经节苷脂为阳性对照药物。将PC12细胞稀释成6×105/mL密度的单细胞悬液，每个浓度均设置3个复孔，以每孔100 μL置于96孔板中，在37 ℃、5% CO2填充的培养箱中孵化24 h，每孔分别加入10 μL MTT试剂染色，孵育6 h，离心，取上层细胞清液，加入DMSO 60 μL，轻轻摇动均匀，用酶标仪检测520 nm波长下的吸光度，采用SPSS 22.0软件对所得数据进行分析，计算 IC50值。结果表明，化合物1、7对5-羟色胺、氨基丁酸、甘氨酸、谷氨酸具有改善作用，2对5-羟色胺、氨基丁酸具有保护作用，11对氨基丁酸、甘氨酸具有保护作用，12对5-羟色胺具有较强的保护作用，见表1。

表1 各化合物对神经递质的 IC50值

5 讨论

本研究从锡叶藤中分离鉴定出13个化合物，均为首次从锡叶藤中分离得到。再测定所得化合物对神经递质(5-羟色胺、氨基丁酸、甘氨酸、谷氨酸)的影响，结果显示化合物1～2、7、11～12具有不同程度的改善作用。本研究可丰富锡叶藤化学成分的资源库，并为保护神经药物的研发提供参考。