大精酸对糖尿病大鼠脂质代谢和内质网应激的影响

唐慧勤， 李 丽， 王 剑， 阎 莉， 吴燕春， 李海涛

(1.广西中医药大学药学院，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学壮瑶药工程中心，广西 南宁 530012；3.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023)

国际糖尿病联盟(IDF)发布了第八版全球糖尿病地图，其显示全球有4.25亿糖尿病患者，预计到2045年，将会有近7亿糖尿病患者。我国成年糖尿病(20～79岁)患病人数达到1.14亿，仍是全球糖尿病患病人数最多的国家[1]。而糖尿病往往引起多种并发症，如糖尿病周围神经病变、糖尿病肾病、糖尿病心肌病等，其发生发展追本溯源主要是因为体内糖、脂肪、蛋白质等物质紊乱引起，尤其是脂质代谢紊乱[2-4]。糖尿病患者由于血糖的增高，脂质代谢发生紊乱，常伴有血脂异常增高现象。大约60%～70%的糖尿病患者在血糖代谢紊乱的基础上常伴有脂质代谢异常，而血脂异常可使糖尿病患者提前出现许多并发症[5-8]。

大精酸(argirein)是从芦荟等中药中提取的活性成分大黄酸(rhein)和L-精氨酸(L-arginine)形成的共晶物，研究发现其可用于防治各种糖尿病的并发症，如糖尿病心肌病、糖尿病肾病、糖尿病性睾丸病、糖尿病并发的男性性功能低下或阳痿等[9-11]。本研究以糖尿病大鼠为实验对象，探讨大精酸对脂质代谢的调节作用和作用机制，为大精酸防治糖尿病并发症提供部分参考依据。

1 材料

1.1 药物 大黄酸(含量>98%)，湖北兴银河化工有限公司，批号20171106；L-Arginine(精氨酸)，北京索莱宝科技有限公司，批号914B036。

1.2 动物 健康SD大鼠，SPF级，体质量约160～180 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(湘)2019-0004，常规饲养于广西中医药大学实验动物中心实验室，分笼饲养，保持12 h/12 h昼夜节律，温度(24±3)℃，相对湿度(60±5)%，自由摄水摄食。

1.3 试剂 胆固醇、牛胆碱钠购自北京中生瑞泰科技有限公司，批号20180410、20180216。盐酸二甲双胍片购自广州白云山天心制药股份有限公司，批号160614。链脲佐菌素(STZ)购自上海前尘生物科技有限公司，批号S0130；甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)购自上海执诚生物科技有限公司，批号ZCDECPO04、ZCJANQO02、ZCNOVL009、ZCMAYQ009、ZCMARR018、ZCJUNQ023，由广西中医药大学第一附属医院检验科全自动分析仪检测。ECL化学发光底物(超敏)、高效RIPA组织/细胞裂解液、BCA、蛋白酶抑制剂混合液(100xPIC)购自北京索莱宝科技有限公司，批号BL523A、R0010、PC0020、P6730；重链结合蛋白(Bip)、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(p-PERK)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、转录激活因子4(ATF4)、半胱胺酸蛋白酶蛋白-12(caspase12)抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司，批号1219R、bs-2469R、bs-2469R、1531R、1105R；CCAAT/增强子结合蛋白(CHOP)、β-actin购自英国Abcam公司，批号ab179803、ab8227。

1.4 仪器 TGL-160高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；ADVIA 2400全自动生化仪(德国Siemens公司)；PowerPac Basic电泳仪和蛋白转印模块(湿转)(美国Bio-Rad Laboratories公司)；Tanon 5200凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；FilterMax F3多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)。

2 方法

2.1 药物样本制备 参考文献[12]报道，称取大黄酸和精氨酸(1∶1)混合放置烧杯中，加入适量的纯水，在80 ℃水浴中保温1.5 h并不断搅拌，趁热抽滤，加入无水乙醇，使含醇量为60%，在60 ℃水浴中减压回收溶剂至体积减半，放至室温，于4 ℃冰箱中静置1周，析晶，抽滤，干燥，即得。

2.2 造模及给药 取SD大鼠60只，体质量160～180 g，自由摄食摄水，适应性喂养1周后，按体质量采用随机分组法分为正常组、模型组、二甲双胍对照组、大精酸高、中、低剂量组共5组，每组12只。除正常组喂食基础饲料外，模型组、二甲双胍对照组、大精酸高、中、低剂量组均给予高脂饲料(配方基础饲料76.6%、胆固醇3%、牛胆碱钠0.4%、油10%、白砂糖10%)喂养，并同时给予各组大鼠相应的药物干预，其中二甲双胍对照组剂量为600 mg/kg，大精酸低、中、高剂量组分别为40、50、60 mg/kg，正常组和模型组给予按1 mL/100 g纯净水，均灌胃给药。连续给药8周后，模型组、阳性组及给药组一次性腹腔注射STZ按40 mg/kg，注射STZ 72 h后采用尾静脉采血空腹测血糖(FBG)，FBG≥11.1 mmol/L者确定为Ⅱ型糖尿病大鼠模型；FBG<11.1 mmol/L者补打1次STZ(40 mg/kg)，使其≥11.1 mmol/L。继续给药5周，实验周期共13周。

2.3 大鼠一般情况观察 观察大鼠进食、饮水、行为、精神状态、毛发、大小便等情况。

2.4 标本采集 13周后，大鼠禁食(不禁水)12 h，末次给药1 h后，10%乌拉坦1 mL/100 g腹腔注射麻醉，取腹主动脉血5 mL，待自然凝固后，3 000 r/min离心10 min，分离血清，用于测定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST。处死后迅速摘取肝脏，生理盐水漂洗，滤纸吸干，分别取适量存于离心管和多聚甲醛中用于后续实验分析。

2.5 血清生化指标检测 采用全自动生化仪，测定大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST水平。

2.6 肝脏中脂质水平检测 同一位置取各组大鼠肝小叶上约300 mg肝组织，加入异丙醇到3 mL，离心后取上清液，用全自动生化仪测定大鼠TC、TG水平。

2.7 肝脏病理形态学检测 取各组大鼠肝脏适量，4%多聚甲醛固定液固定，HE染色，病理切片，镜下观察肝脏脂肪变性情况。

2.8 蛋白免疫印记(Western blot)检测蛋白表达 取适量肝组织加入冷裂解液后匀浆、离心提取总蛋白，核蛋白采用核蛋白提取试剂盒分离提取。BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离蛋白，结束后取出分离胶，移至PVDF膜上，用TBST配置的8%脱脂奶粉封闭液封闭3 h；按照相应抗体说明书稀释抗体，4 ℃孵育12 h；洗膜，二抗稀释液室温孵育1 h后，TBST洗膜，匀滴加ECL化学发光液后进行曝光显影。

3 结果

3.1 一般情况观察 正常组大鼠活动、饮食饮水正常，无死亡现象；模型组大鼠腹腔注射STZ后，出现毛色变黄稀疏、行动迟缓、精神不振、多饮多尿，尿液散发烂苹果味等现象；与模型组比较，各干预组大鼠均有不同程度的改善。整个造模期间，正常组无死亡，模型组有4只大鼠死亡，大精酸高、中剂量组各有2只大鼠死亡。

3.2 血清生化指标 与正常组比较，模型组大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均升高，其中TC、TG、LDL-C水平更明显(P<0.05)。与模型组比较，阳性药二甲双胍可以降低TC、TG、LDL-C水平(P<0.05)，对HDL-C影响不大；大精酸中剂量使TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.05)，HDL-C变化不大。见表1。与正常组比较，模型组大鼠的ALT活性升高(P<0.05)；与模型组比较，除二甲双胍组ALT活性升高(P<0.05)外，其余无显著差异(P>0.05)，见表2。

表1 大精酸糖尿病大鼠血脂的影响

表2 大精酸对糖尿病大鼠肝功能的影响

3.3 肝脏脂质 相对于正常组，模型组大鼠肝脏中TC、TG水平升高(P<0.05)；相对于模型组，二甲双胍能降低TC、TG水平(P<0.05)，大精酸各组大鼠的TC、TG水平有不同程度的降低，其中各剂量组TC水平更明显(P<0.05)，低剂量组TG水平更明显(P<0.05)。见表3。

表3 大精酸对糖尿病大鼠肝脏脂质的影响

3.4 肝细胞HE染色 正常肝细胞呈放射状排列，大小正常，胞质分布均匀，肝小叶组织结构完整；模型组大鼠肝细胞索和肝小叶消失，肝细胞排列无序，胞浆空泡化、核淡染，脂肪融合大空泡的出现把胞核挤到一边，出现弥漫性的脂肪变性；二甲双胍组肝细胞形态基本规则，细胞变大，胞浆有细小脂滴，但脂肪变性程度相对较轻；大精酸低剂量组胞浆可见数量不等的脂滴，有少数较大的空泡存在；中剂量组肝细胞体积增加稍有减轻，细胞内有少许脂肪空泡，脂肪变性程度较轻；高剂量组肝细胞变大，胞浆可见一定数量的大脂滴。见图1。

图1 大精酸对糖尿病大鼠肝脏组织病理组织学的影响(HE染色，×200)

3.5 对大鼠肝脏CHOP、Bip、p-PERK/PERK、ATF4、caspase12蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠肝脏组织中CHOP、Bip、p-PERK/PERK、ATF4、caspase12的蛋白表达均升高(P<0.05)；与模型组比较，大精酸各组的CHOP、Bip、p-PERK/PERK、ATF、caspase12蛋白表达降低 (P<0.05)。见图2。

注：与正常组比较，ΔP<0.05；与模型组比较，*P<0.05。图2 各组大鼠肝脏组织中CHOP、Bip、PERK/p-PERK、ATF4、caspase12蛋白表达(n=3)

4 讨论

糖尿病是一种代谢异常综合征的疾病，研究表明大约50%的糖尿病患者在血糖代谢紊乱的基础上常伴有脂质代谢异常，因此糖尿病患者不光需要控制血糖，调节脂质代谢也是一项重要的措施。本研究中，大精酸不但可以降低血清TC、TG、LDL-C水平，表现出良好的调节血脂作用，还可减少肝细胞内脂滴，防止大空泡的形成，使肝组织中的TC、TG水平也降低。说明大精酸可以降低脂质在肝脏中的沉积，明显改善肝脏病理组织改变，调节血脂异常，从而防治糖尿病大鼠脂质代谢异常。

如果人体血液循环中的游离脂肪酸(FFA)异常增加，超过了机体的代谢能力，会对肝细胞产生脂毒性，导致肝损伤发生[13]。肝损伤是糖尿病中的一种并发症，肝脏细胞的损伤则会引起血清中由肝细胞合成的丙氨酸氨基转移酶升高的异常升高[14]。本研究发现，与正常组比较，模型组大鼠AST、ALT的水平都升高，说明糖尿病大鼠存在着一定的肝损伤。虽然二甲双胍组的降脂作用很明显，但其升高了ALT水平，加重了肝损伤。大精酸虽然不能降低AST、ALT水平，但与模型组比较，也没有引起AST、ALT水平升高(P>0.05)，相对来说大精酸对肝没有造成更严重的伤害性。

此外过多的FFA转运进入肝脏，是形成肝脏胰岛素抵抗(IR)和非酒精性脂肪性肝炎(NAFLD)的重要因素。NAFLD患者体内摄入过多的饱和脂肪酸时，会诱发肝脏炎症反应和ERS[15]。而在富含TG的VLDL进入内质网进行装配、与载脂蛋白结合转运出去的过程中，过多的肝脏脂质通过滑面内质网(SER) 时也会引起ERS。作为一把“双刃剑”，ERS早期可以维持细胞正常功能，但强烈或持续的应激存在时，则会启动细胞凋亡机制，造成细胞损伤[16-17]。细胞要维持内质网的稳态，可以通过非折叠蛋白反应(UPR)激活一系列信号通路来实现，其主要包括3条通路：PERK通路，IRE1α通路和ATF6 通路[18-19]。上述信号通路中，PERK是位于 ER 膜上的跨膜转录因子[20]。在NAFLD模型中发现脂毒性诱导PERK途径的细胞凋亡。高脂喂养的小鼠肝脏中ERS 标志蛋白PERK、IRE1α 表达增高[21]。当ERS发生时，PERK从Bip解离，生成p-PERK。本课题组对PERK活化的研究结果发现，模型组大鼠肝脏中p-PERK/PERK比值增加，说明p-PERK明显增多，而用大精酸处理后其表达又降低，证实大精酸处可以抑制内质网应激信号通路的激活。激活的PERK磷酸化eIF-2α 51 位的丝氨酸(Ser51)，从而对ATF4 mRNA 的翻译产生诱导作用，ATF4 mRNA活化后激活其下游分子CHOP的表达[22-23]。在哺乳动物细胞中，CHOP处于普遍表达的状态，是ERS引发凋亡的信号。在高脂喂养造成的小鼠脂肪肝模型中，肝细胞CHOP、caspase12 mRNA及蛋白表达均升高，凋亡程序发生变化，说明脂肪肝中肝细胞的凋亡是由内质网应激引起的[24]。本研究中，模型组大鼠肝脏ATF4、CHOP蛋白表达显著升高，而大精酸可以抑制ATF4、CHOP的表达，表明大精酸能够通过抑制PERK-ATF4-CHOP信号通路，抑制内质网应激相关细胞凋亡，从而改善脂质代谢。大精酸能明显抑制肾脏、心肌、成纤维细胞和炎症在内质网应激中的生物记号PERK的上调及凋亡相关基因的异常[9-11,25]。大精酸是大黄酸和L-精氨酸以弱共价键形成的超分子化合物，其进入体内释放出大黄酸和精氨酸从而发挥双重作用。有研究发现大黄酸可通过抑制固醇调节元件结合蛋白(STEBP-1c)的转录，增加能量消耗，降低TC和TG水平，从而减少肝脏脂肪沉积，改善肝脂肪变性[26]。大黄酸被证实抑制人前体脂肪细胞增殖与分化与CHOP表达上调有关[27]。精氨酸(Arg)是人体内必需氨基酸，在Arg缺乏时，外周血有丝分裂原激活的T淋巴细胞和Jurkat细胞的CHOP表达和XBP-1mRNA剪接会升高，导致ERS[28]。同样在卵巢腺癌细胞(SKOV3)、胶质母细胞瘤细胞(U251)、人结肠癌细胞(HCT-116)等人实体瘤中发现Arg饥饿诱导了ERS[29]。

另外一条由内质网介导凋亡途径是caspases级联反应。已有报道显示，在小鼠的肝细胞中，发现有内质网应激相关基因和特异性的表达[30]。与有caspase 12表达的细胞比较，caspase 12缺陷细胞更能抵抗对内质网应激介导的凋亡。本研究发现，大精酸也可以降低caspase 12的表达，从而抑制内质网应激。

然而，本研究药物没有体现出量效关系，原因主要有两点：一是受剂量梯度的影响。本研究中所设剂量是根据前期预实验结果决定。在预实验中，设定了200、100、75、50、25 mg/kg等剂量梯度，发现剂量过高时，如200、100 mg/kg剂量下，大鼠出现大便溏烂、呈黄红色，毛黄稀疏，精神不振等情况，而75 mg/kg剂量下，大鼠情况有所好转。而剂量过低，如25 mg/kg剂量下，大鼠无上述反应，但没有调脂作用。在50 mg/kg时，大鼠生理状态与正常组相似，且实验结果较理想和稳定，故选用了60、50、40 mg/kg的剂量梯度，而不是2～3倍的剂量比。二是大精酸作为大黄酸和精氨酸的共晶化合物，在被人体吸收的过程中，可能发生了构象改变或是释放出大黄酸和精氨酸的速度不一致而造成活性改变，体现不出量效关系。本课题下一步计划是在细胞上深入探讨大精酸的脂质调节作用和检测其药物动力学指标，以进一步揭示其作用机制、药效及药动学的关系。

综上所述，本文研究了大精酸对糖尿病大鼠脂质代谢的影响及其机制。结果表明，大精酸能够降低血脂和肝脏脂质，减轻肝细胞脂肪样病变，该作用可能与下调了CHOP、Bip、p-PERK/PERK、ATF4、caspase12等内质网应激相关蛋白表达有关。