美洲大蠊提取物外用乳胶对大鼠烫伤模型的影响

王 爽， 赵宇明， 高 新， 王雨婷， 田园园， 韩 静*

(1.沈阳药科大学制药工程学院，辽宁 沈阳 110016；2.沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳 110016)

烧烫伤是我们生活中常见且难以治疗的外伤疾病，如果不能及时妥善的处理，可能会造成非常严重的后遗症。目前治疗烧烫伤的化学药物较多，如抗菌化学药物、银盐等，主要作用是抗菌、消炎、镇痛，但化学药物普遍存在有一些不良反应、烧烫伤的创面肌肤组织再生能力的促进效果比较差等不足之处[1]。美洲大蠊P.americana为蜚蠊科大蠊属昆虫，《神农本草经》和《本草纲目》中都有其入药记载。现在医学表明，美洲大蠊乙醇提取物具有氨基酸、多肽、糖类等多种有效成分，具有抗菌、消炎、镇痛、促进组织愈合、提高人体免疫力等功效[2-3]，临床上主要用于治疗烧伤、烫伤、瘘管、胃溃疡、十二指肠溃疡等疾病[4]。本课题组为了克服液体制剂滞留时间短，不稳定等缺点，研制出一种以美洲大蠊提取物为主要有效成分的外用乳胶。建立大鼠烫伤模型，将乳胶外敷于大鼠深Ⅱ度烫伤创面，证明其对烫伤愈合的促进作用并阐明其促进愈合的机制。

1 材料

1.1 动物 清洁级SD大鼠74只，雌雄各半，体质量(240±20)g，由沈阳药科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(辽)2015-0001，在实验室适应性饲养7 d后进行实验。动物使用及处理方法严格按照沈阳药科大学动物实验伦理委员会的要求进行。

1.2 试剂与仪器 血管内皮生长因子酶联免疫检测试剂盒、肿瘤坏死因子-α酶联免疫检测试剂盒、白细胞介素-1酶联免疫检测试剂盒(上海樊克生物科技有限公司)。美洲大蠊提取物浸膏(云南成满生物科技有限公司)；新疆紫草(北京同仁堂亳州饮片有限责任公司)；其他所用试剂均为分析纯。iMark酶标仪(上海领成生物科技有限公司)；H1850高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；FSH-2组织匀浆机(常州荣华仪器制造有限公司)。

1.3 试剂与药物 美洲大蠊提取物外用乳胶主要由美洲大蠊浸膏制得。具体制备方法如下：称取卡波姆940，加入适量水，放置过夜使其充分溶胀，溶胀后加入丙三醇，搅拌均匀，形成乳胶基质。取新疆紫草，经橄榄油加热提取后过滤，制得紫草油。将取紫草油和吐温80混合到乳钵中，待充分混匀溶解后，加入少量蒸馏水，同一方向搅拌形成初乳。在初乳中加入蒸馏水均匀搅拌，将初乳稀释成乳液，将乳液加入到乳胶基质中。将美洲大蠊提取物浸膏加少量水稀释，加入到乳胶基质中，搅拌均匀，加入少量的三乙醇胺调节乳胶pH值，使其pH值达到6～7之间。制得的成品乳胶为质地均匀，淡粉色的半固体，附着性和延展性良好。对其性状、离心实验、微生物限度、稳定性等质量指标进行控制。

2 方法

2.1 模型建立 采用水浴烙铁法[5-6]建立烫伤模型。实验前24 h，先将大鼠长毛剪去，再用8%硫化钠水溶液大鼠脱去背部毛发，用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g的剂量腹腔注射将大鼠麻醉，在给药5 min后，将其固定在大鼠解剖板上，使其背部向上。将50 g的天平砝码放入沸水中加热5 min，取出后立刻用干纱布擦去底部水滴，迅速接触大鼠皮肤10 s，造成大鼠深Ⅱ度烫伤。每只大鼠背部两侧各烫伤1次，烫伤后在大鼠腹腔注射乳酸林格氏液5 mL抗休克。大鼠颈部使用胶带固定以防止其舔舐药物。

2.2 分组及给药 根据体质量对大鼠进行分组，每组雌雄各6只，体质量保持相近，分笼饲养，将未分组的2只大鼠烫伤后立即处死，取其创面组织做病理组织学检查。实验动物分组及给药情况如表1所示，每组12只大鼠分笼饲养，置于温度20 ℃、相对湿度50%环境中，自由摄食饮水。给药组分别在烫伤部位涂相应的药物0.5 g/只，给药部位用无菌纱布包扎，各个给药组每天给药两次(早晚各一次)，连续给药21 d。

表1 大鼠分组及给药情况

2.3 指标检测

2.3.1 创面愈合情况 观察创面愈合情况，包括结痂、脱痂、愈合时间及恢复情况，对结痂、脱痂进行判定。采用透明膜创面测量法分别在第1、3、7、14、21天对每个创面进行描记并在实验结束后归类整理；用剪刀沿透明膜上每个创面以及标准面积单位的边缘切割，然后放置在分析天平上称取质量，计算创面愈合率[7]，公式为创面愈合率=[(初始烫伤面积-未愈合创面面积)/初始烫伤面积]×100%。

2.3.2 组织病理学观察及VEGF水平检测 造模后第 3、7、14、21天，每个时间点分别处死各组大鼠2只。另取创面全层皮肤组织100 mg左右，去除痂皮，用滤纸吸去血迹，称重，放入生理盐水中碾磨制成匀浆。采用ELISA法测VEGF水平，具体步骤按试剂盒说明书进行。治疗21 d后，取剩余大鼠烫伤部位全层皮肤，按常规方法制备石蜡切片，HE染色，显微镜下观察病理结果。

2.3.3 大鼠血清TNF-α，IL-1水平检测 分别在烫伤后24、48 h每组各取3只大鼠，进行眼眶取血。将血液离心后取血清，采用ELISA 法测定血清TNF-α、IL-1水平，具体步骤按试剂盒说明书进行[8]。

3 结果

3.1 美洲大蠊乳胶对创面愈合情况的影响

3.1.1 创面外观变化 如图1所示，烫伤后创面立刻变成灰白色，创面平滑、水肿，可明显区分烫伤和未烫区域，皮肤弹性降低，韧性增加。各组大鼠烫伤后精神萎靡，饮食减少。第1～2天，各组大鼠精神状态逐渐恢复，饮食量逐渐增加。低剂量组和高剂量组大鼠水肿明显消去，创面逐渐变硬；美洲大蠊提取物对照组大鼠仍有轻微水肿情况，创面发白；紫草油对照组和凝胶基质对照组的大鼠水肿明显，创面发白。第3天，低剂量组和高剂量组大部分大鼠创面开始结痂；美洲大蠊提取物对照组创面颜色变深，水肿完全消退；其他三组大鼠创面仍为灰白色。第7天，低剂量组和高剂量组大鼠均痂皮边缘有所脱落；其他各组大鼠痂皮颜色进一步加深。第14天，低剂量组和高剂量组大部分大鼠痂皮脱落，脱痂后的创面可明显见到新生肉芽组织；美洲大蠊提取物对照组仅少部分大鼠脱痂；其余各组均未脱痂。第21天，低剂量组和高剂量组所有大鼠均已脱痂完成，创面基本痊愈；美洲大蠊提取物对照组大部分大鼠开始脱痂；紫草油对照组仅少部分大鼠开始脱痂；其余两组大鼠均未脱痂，其中模型组大部分大鼠痂皮较厚，表面粗糙、干燥。

注：A为低剂量乳胶组，B为高剂量乳胶组，C为提取物对照组，D为紫草油对照组，E为凝胶基质对照组，F为模型组。图1 烫伤后各组大鼠创面外观图

3.1.2 创面愈合率 于烫伤后1、3、7、14、21 d统计创面愈合率。结果显示，烫伤后前5天各组烫伤组织创面愈合率无明显差异，但随着时间延续，各用药组大鼠创面愈合率呈明显上升趋势。如表2所示，烫伤后第7天，低剂量组、高剂量组和美洲大蠊提取物对照组大鼠创面愈合率提高(P<0.05)；烫伤后第14天，由于部分大鼠创面开始脱痂，低剂量组和高剂量组愈合率提高(P<0.01)，其他各组愈合率也出现明显变化；烫伤后21 d，低剂量组和高剂量组大鼠创面均已痊愈，其中高剂量组创面愈合率最高(P<0.01)，其他各组大鼠愈合率也明显提高。

表2 不同时间点各组大鼠创面愈合率

3.2 美洲大蠊乳胶对病理组织形态及VEGF水平的影响

3.2.1 组织病理学观察 在治疗21 d后，将剩余大鼠处死后，取创面进行组织病理学观察。图2为6组大鼠病理切片对比图，由图可知低剂量组和高剂量组大鼠创面都已经恢复完全，上皮组织较厚，细胞角质化明显，可清晰看到大量的毛囊和皮脂腺；美洲大蠊提取物对照组和紫草油对照组大鼠上皮得到较好的恢复，可观察到恢复的毛囊和皮脂腺，但仍可见炎症细胞浸润；而凝胶基质对照组和模型组的大鼠上皮虽然有所恢复，但未见恢复的毛囊和皮脂腺，皮下大量炎症细胞浸润。

注：A为低剂量乳胶组，B为高剂量乳胶组，C为提取物对照组，D为紫草油对照组，E为凝胶基质对照组，F为模型组。图2 各组大鼠创面皮肤组织病理切片图(500 μm,×400)

3.2.2 VEGF 随着时间的延续，各组大鼠创面VEGF水平逐渐增加。在烫伤后第3天各组烫伤创面组织VEGF无明显差异；烫伤后第7天，高剂量组大鼠创面VEGF水平与模型组比较增加(P<0.05)；在烫伤后第14天，前3组与模型组比较，创面VEGF水平增加(P<0.05；P<0.01)；烫伤后第21天，前3组大鼠创面VEGF水平进一步提高，与模型组比较有统计学意义(P<0.01)，紫草油对照组大鼠创面VEGF水平与模型组比较亦然(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠创面组织VEGF水平的比较

3.3 对烫伤大鼠血清中TNF-α和IL-1水平的影响 烫伤后24、48 h，各组大鼠血清中TNF-α水平呈明显下降趋势，其中前三组与模型组比较有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。烫伤后24 h，低剂量组和高剂量组大鼠血清中IL-1水平与模型组比较有统计学意义(P<0.05)，其他组与模型组比较无显著性差异；烫伤后48 h，各组血清中IL-1水平下降，其中前3组与模型组比较有统计学意义(P<0.05,P<0.01)，见表4。

表4 烫伤后各组大鼠血清TNF-α、IL-1水平的比较

4 讨论

由美洲大蠊提取物制得的康复新液具有通利血脉，养阴生肌的功效，临床主要用于治疗外伤、烧烫伤、胃溃疡等疾病[4]，但液体制剂存在滞留时间短、难以储存等缺点。本课题组为了克服康复新液在临床使用上的缺点，将美洲大蠊提取物加入凝胶基质和紫草提取物等材料制成外用乳胶，该乳胶利用乳化剂使紫草油与水形成形成O/W型乳滴，使其均匀稳定地存在于凝胶基质中。由于乳胶具有网状交联结构，使得乳胶性状稳定，可保持提取物中多肽和氨基酸水平。该乳胶质地柔润、吸水性强且粘附性好，可粘附在伤口外使其中的有效成分能与伤口持续接触防止创面过于干燥，同时隔离外界的病原微生物等有害物质，对伤口起到一定的保护作用。

低剂量组和高剂量组对大鼠创面作用效果显著，两组大鼠在各时间点创面外观变化明显且愈合率高，在治疗结束后两组大鼠创面均已愈合，而其他各组大鼠创面并没有完全愈合。这说明美洲大蠊乳胶能加速伤口恢复，缩短愈合时间。病理组织观察结果也进一步印证了创面外观观察的结果，低剂量组和高剂量组大鼠皮肤组织可清晰看到恢复的上皮组织、毛囊、皮脂腺等，没有浸润的炎症细胞。而其他各组恢复程度不一，但各切片均可见数量不一的炎症细胞，说明其创面并没有得到完全恢复。

烧烫伤修复一般包含抗炎期、增生期、结疤期和重塑期等阶段[9]。烧烫伤初期，机体在免疫系统作用下会发生一系列炎症反应以清除受损组织和异物，并能抵抗细菌、病毒等外来物质。常见的炎症因子有肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1(IL-1)等。当机体严重烧烫伤时，会造成炎症因子释放过量，从而引起机体反应过度，影响创面恢复甚至造成全身性炎症反应[10]。在本实验研究中，两个乳胶治疗组(低剂量组和高剂量组)的TNF-α和IL-1水平于模型组比较有差异，表明该乳胶能减轻炎症反应，改善局部微循环。细胞因子是损伤组织修复过程中重要的促进剂，参与组织修复的全过程，其水平将直接影响创面的愈合进程和修复质量。血管内皮生长因子(VEGF)是常见的细胞因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用[11-12]。在本实验中，给药7 d后给药组的创面VEGF水平与模型组相比有差异，且在给药14 d和21 d后差异最为显著，说明美洲大蠊提取物制备的乳胶能有效增加创面组织VEGF 的释放，能加速创面愈合。

综上所述，美洲大蠊提取物乳胶对大鼠深Ⅱ度烫伤具有良好的保护作用，能加速大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合，其原理可能与促进创面组织VEGF的释放，降低大鼠体内TNF-α、IL-1水平等有关。本研究为美洲大蠊外用乳胶的进一步应用奠定了理论基础，并为美洲大蠊提取物外用制剂的开发提供了新的思路。