黑种草保健茶水浸液对OVA诱导小鼠过敏性哮喘的作用

廖成松， 韩阳阳， 陈志婧

(1.锡林郭勒生物工程研究院，内蒙古 锡林浩特 026000；2.锡林郭勒职业学院，内蒙古 锡林浩特 026000)

过敏性哮喘是由包括肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T细胞等多种细胞参与的慢性气道炎症类疾病，已成为全球性公共卫生领域的重大问题[1]。据不完全统计，目前全世界各个年龄段患哮喘疾病的人数高达3.39亿[1]。过敏性哮喘以支气管粘膜增厚、水肿、黏液分泌过多、嗜酸性细胞浸润等为主要特征，其发病机制与T细胞、炎症细胞因子、IgE、Th1/Th2 细胞功能失衡等密切相关[2-4]。家黑种草、甘草、小茴香、茶叶均具有抗炎、抗氧化、抗过敏等作用，是国内外传统方剂中的重要成分[5-10]。Schleicher等[11]报道，将家黑种草、甘草、小茴香和茶叶按照一定比例混合制作成黑种草保健茶有显著的提高免疫力，缓解过敏性疾病症状的作用。本研究通过构建OVA诱导的过敏性小鼠哮喘模型，观察了该黑种草保健茶对哮喘模型小鼠肺部炎症和肺组织病理变化的影响，并对其作用机制进行了初步探讨。

1 材料

1.1 试剂与药物 家黑种草子为黑种草属植物家黑种草Nigellasativa的干燥种子，产地新疆伊犁，批号YL20200202；甘草为甘草属植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch的干燥根，产地新疆伊犁，批号200101；小茴香为伞形科植物茴香FoeniculumvulgareMill.的干燥成熟果实，产地甘肃武威，批号191001，以上药材均购于安徽嘉佑中药饮片有限公司，经内蒙古锡林郭勒盟蒙医医院贡斯琴主任医师鉴定为正品。红茶购于内蒙古锡林浩特市德克隆超市。

卵蛋白(OVA)(Ⅴ级，美国Sigma公司，货号A5503，批号BC88709X)；氢氧化铝凝胶(美国Thermo Fisher Scientific公司，货号77161，批号UE284411B)；地塞米松磷酸钠注射液(国药集团容生制药有限公司，批号13011911)；迪夫快速染色液(北京索莱宝科技有限公司，货号G1540，批号20190808)；苏木精(货号H9627，批号SLBN3 249 V)、伊红(货号E6003，批号62R80915X)(美国Sigma公司)；PAS染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号G1281)；姬姆萨(Giemsa)染色试剂盒(上海源叶生物科技公司，货号R20649)；IL-4 ELISA试剂盒(货号88-7044)、IL-5 ELISA试剂盒(货号88-70540)、IL-13 ELISA试剂盒(货号88-7137)、IL-10 ELISA试剂盒(货号BMS614INST)、IL-12 ELISA试剂盒(货号BMS616)、IFN-γ ELISA试剂盒(货号BMS606INST)、IgE ELISA试剂盒(货号88-50460)、IgG1 ELISA试剂盒(货号88-50410)(美国Invitrogen公司)；BCA蛋白试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，货号P0012)。其余试剂均为国产分析纯。

1.2 动物 BALB/c小鼠72只，雄性，5周龄，SPF级，购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，动物生产许可证号SCXK(沪)2017-0012。

1.3 仪器 FZ102微型植物粉碎机(临沂正衡化玻仪器有限公司)；SC-AC-1200AS型电子天平(苏州新区苏测电子科技有限公司)；RM2235型轮转式切片机(德国Leica公司)；TEC 2500型病理组织漂烘仪(常州市郝思琳医用仪器有限公司)；BX43型显微镜(日本Olympus公司)；PYX-DHS500BS-Ⅱ型隔水式恒温培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)；SPectraMax Plus 384型全波长酶标仪(美国MD公司)；80-2型台式低速离心机(上海医疗器械有限公司)。

2 方法

2.1 黑种草保健茶水浸液制备 将家黑种草子、甘草、小茴香、红茶用粉碎机粉碎成粉末，称取家黑种草子粉末80 g，倒入容器中，加入200 mL热水充分溶解，再加入甘草、小茴香、红茶粉末各26.6 g，再加入200 mL热水，混合均匀，加盖浸泡10 min，3 000 r/min 离心10 min，取上清液，即得，药液质量浓度为0.4 g/mL。

2.2 模型建立 根据Bui等[12]报道的方法建立，并稍加改进。小鼠在第1天腹腔注射致敏液(0.2 mL/只，含50 μg OVA、1 mg 氢氧化铝凝胶)，第14天再腹腔注射致敏液(0.2 mL/只，含50 μg OVA)，第27～29天以5%OVA 溶液雾化激发，每次20 min。正常组小鼠给予同体积PBS致敏雾化。

2.3 分组与给药 72只小鼠实验前适应性饲养1周，根据体质量随机分成6组，每组12只，分别为正常组、OVA模型组、地塞米松组及黑种草保健茶低、中、高剂量组，正常组小鼠以PBS代替来进行致敏和雾化激发，其他5组按“2.2”项下方法构建模型，第15～26天各组进行12 d的药物干预，其中黑种草保健茶低、中、高剂量组剂量分别为20、40、80 mg/kg，正常组给予相同体积PBS溶液。地塞米松组给药剂量为0.5 mg/kg，每天腹腔注射1次。

2.4 雾化现象观察与评分 按照王慧珠等[13]报道，从雾化开始观察10 min内小鼠的哮喘行为并打分，无抓鼻或挠痒动作记0分，抓鼻或挠痒1～3 次记1分，4～6 次记2分，7 次及7 次以上记3分；小鼠无哮喘症状记0分，出现轻微的哮喘症状记3分，出现呼吸急促、呼吸频率明显加快或焦躁不安等哮喘典型症状记6分，出现严重的呼吸困难(如急促点头、腹式呼吸等哮喘症)状记9分。

2.5 支气管灌洗液(BALF)收集与细胞分类计数 剪开小鼠胸腔，细线结扎右肺支气管，从气管插入灌洗针连接注射器，细线结扎灌洗针防止脱落和漏气，吸取0.3 mL PBS经气管进入左肺，反复抽吸3次，回收的液体放入EP管内收集，重复3次，以回收率>80%为合格。BALF在1 500 r/min、4 ℃下离心10 min，吸取上清液移至1.5 mL EP管中，在-20 ℃下保存，用于测定细胞因子。底部沉淀物用20 μL PBS溶液重悬，混匀，取2 μL于载玻片上，均匀涂开，晾干，迪夫快速染色液进行染色，在400倍显微镜下观察拍照，每张玻片选择3个视野，用于细胞分类与计数。

2.6 肺组织病理学观察 剪取未灌注小鼠右肺上半部分，放入4%甲醛中固定3～5 d，石蜡包埋后切成厚度4 μm的薄片，分别进行HE、PAS、Giemsa染色，在200倍显微镜下观察肺部炎症细胞浸润等病理变化。

2.7 BALF、肺组织中细胞因子水平测定 取小鼠未灌右肺下半部分，称定质量，加入20倍4 ℃ PBS溶液，在匀浆器中研磨成5%肺匀浆，静置15 min，在3 500 r/min、4 ℃下离心15 min，吸取上清液，在-20 ℃ 保存待测。根据ELISA试剂盒说明书操作方法，分别检测“2.5”项下BALF和肺组织匀浆中IL-4、IL-5、IL-13、IL-10、IL-12、IFN-γ水平，BCA试剂盒进行蛋白校正。

2.8 血清中IgE、IgG1水平测定 小鼠摘眼球取血，静置1 h，在3 500 r/min下室温离心 15 min，取血清，根据ELISA试剂盒说明书操作方法检测血清中IgE、IgG1水平。

3 结果

3.1 黑种草保健茶对小鼠哮喘行为学、体质量的影响 正常组小鼠在整个实验过程中体质量持续增长，外观表现正常；OVA诱导使小鼠表现出烦躁易怒、抓耳挠鼻、呼吸异常、频率高、急促等现象，经黑种草保健茶水浸液干预后上述症状有不同程度的缓解。如表1所示，造模后药物干预前，OVA模型组、各给药组哮喘行为学评分均高于正常组(P<0.01)；经过12 d药物干预后，与OVA模型组比较，黑种草保健茶组、地塞米松组小鼠哮喘行为学评分均降低(P<0.05,P<0.01)。如表2所示，第30天时与正常组比较，OVA模型组小鼠体质量降低(P<0.01)；与OVA模型组比较，黑种草保健茶组小鼠体质量有不同程度的增长，以高剂量组更明显(P<0.05)。

表1 黑种草保健茶对小鼠哮喘行为学的影响 (分，

表2 黑种草保健茶对小鼠体质量的影响

3.2 黑种草保健茶对小鼠炎症细胞数量的影响 如图1所示，与正常组比较，OVA模型组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、细胞总数目增加(P<0.05，P<0.01)；给予黑种草保健茶、地塞米松后，均能不同程度降低炎症细胞数量，以黑种草保健茶高剂量组更明显(P<0.05，P<0.01)。

注：黑色箭头指示中性粒细胞，红色箭头指示嗜酸性粒细胞，桔红色箭头指示单核细胞。与正常组比较，#P<0.05，## P<0.01；与OVA模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。图1 黑种草保健茶对小鼠BALF中炎症细胞数量的影响(×400)

3.3 黑种草保健茶对小鼠肺组织病理变化的影响 如图2所示，与正常组比较，OVA模型组小鼠肺组织支气管周围有明显的炎性细胞浸润与黏液分泌，并可见支气管壁明显增厚的现象；相对于模型组，各给药组小鼠炎性细胞显著减少，支气管壁增厚现象得到不同程度缓解，病理改变明显减轻。PAS染色可见，与正常组比较，OVA模型组小鼠肺组织支气管可见大量阳性杯状细胞，表明支气管有明显的感染；各给药组小鼠肺组织支气管未见明显的阳性杯状细胞，均能有效抑制炎症感染的发生。Giemsa染色发现，与正常组比较，模型组小鼠肺组织支气管周边出现大量单核细胞，而各给药组小鼠肺组织支气管周边单核细胞数量明显减少。

注：绿色箭头指示炎性细胞，黑色箭头指示杯状细胞，红色箭头指示单核细胞。图2 黑种草保健茶对小鼠肺组织病理学变化的影响(×200)

3.4 黑种草保健茶对小鼠BALF、肺组织中细胞因子水平的影响 如表3～4所示，与正常组比较，OVA模型组小鼠BALF、肺组织中与Th2型细胞因子相关的IL-4、IL-5、IL-13水平升高(P<0.01)，而与Th1型细胞因子相关的IL-12、IFN-γ水平及与Treg细胞因子相关的IL-10水平降低(P<0.01)；与模型组比较，黑种草保健茶组、地塞米松组小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平不同程度降低，IL-12、IFN-γ、IL-10水平不同程度上升，以黑种草保健茶高剂量组更明显(P<0.05，P<0.01)。

表3 黑种草保健茶对小鼠BALF中细胞因子水平的影响

表4 黑种草保健茶对小鼠肺组织中细胞因子水平的影响

3.5 黑种草保健茶对小鼠血清中IgE、IgG1水平的影响 如图3所示，与正常组比较，OVA模型组小鼠血清中IgE、IgG1水平升高(P<0.01)；与模型组比较，黑种草保健茶中剂量组小鼠血清中IgE水平降低(P<0.05)，高剂量组两者水平均降低(P<0.05)。

注：与正常组比较，## P<0.01；与OVA模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。图3 黑种草保健茶对小鼠血清中IgE、IgG1水平的影响

4 讨论

家黑种草原产于南亚和西南亚，在中东地区和伊斯兰国家应用广泛，是传统药方的重要组成成分之一[14]。现代研究结果证实家黑种草具有抗炎、抗菌和抗氧化、抗肿瘤、抗缺血、抗糖尿病、免疫调节等多种药理作用[5-7,15-16]。另外，黑种草提取物中的百里醌能抑制IL-4和OVA特异性IgE的产生，限制TNF-α和IL-1β相关基因的表达[17]，而提取物中所含二硫醌、百里醌、对二苯醌等生物化学物质能显著提高呼吸道黏液纤毛清除率，增加呼吸清除率，具有很强的平喘功能[18-19]。甘草和小茴香广泛应用于我国传统方剂，研究表明甘草具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗菌等药理作用[8]，小茴香具有抗病毒、抗氧化、驱虫剂、抗菌、抗炎、祛痰、解痉等药理作用[9]。茶叶是众多民族偏方里的组成部分，现代研究表明，茶叶中的茶多酚、儿茶素、甲基化儿茶素、茶皂素、茶黄素等功能成分具有一定的药理和保健作用，比如抗过敏作用[10]。本研究根据Schleicher等[11]报道的搭配比例，将家黑种草、甘草、小茴香和茶叶按照3∶1∶1∶1的比例混合制作成黑种草保健茶，采用 OVA 小鼠哮喘模型，观察黑种草保健茶水浸液对过敏性哮喘的抑制作用。结果显示，黑种草保健茶不仅能明显缓解哮喘行为、改善哮喘小鼠体质量增长缓慢的现象，显著降低BALF中炎症细胞的数量，而且显著降低血清中IgE 和IgG1水平，显著减轻肺组织病理学变化，包括减少肺组织中炎性细胞数量、缓解支气管壁增厚的现象等。与此同时，黑种草保健茶能显著降低哮喘小鼠BALF和肺组织中Th2细胞因子水平，提高Th1和Treg细胞因子水平。

众所周知，哮喘是气道炎症性疾病，T细胞和嗜酸粒细胞是主要参与的2类重要炎性细胞[20]。BALF和肺组织中炎性细胞数量及其变化能直接反应哮喘的发生程度及其变化趋势[21]，黑种草保健茶能明显降低BALF和肺组织中炎性细胞数量，对于减缓哮喘加重有重要作用。研究表明，CD4+T细胞主要受Th1和Th2细胞因子以及Treg细胞的调节[22-23]。IL-12和IFN-γ 是典型的Th1型细胞因子，具有活化巨噬细胞的作用。Th2 细胞反应与炎症密切相关，其主要分泌的IL-4、IL-5和IL-13能诱发T细胞增殖，促使未成熟的T细胞分化为Th2细胞，同时介导B细胞合成IgE和IgG1以及嗜酸性粒细胞浸润[24]。IL-10是Treg细胞分泌的主要细胞因子，具有抑制多种炎症介质合成的作用，能有效减轻气道炎症和气道高反应的相应症状，改善炎症类疾病[25]。Th1和Th2存在明显的相互调节关系，支气管哮喘的典型特征之一是Th2反应增强Th1反应减弱导致Th1/Th2失衡[26]。而Treg细胞能有效抑制Th2反应[27]，从而调节Th1/Th2的平衡。本研究发现，黑种草保健茶通过增加哮喘小鼠BALF和肺组织中Th1型白介素(IL-12、IFN-γ)和Treg(IL-10)的分泌，从而抑制Th2型白介素(IL-4、IL-5、IL-13)的分泌，调节Th1/Th2/Treg的失衡，进而减少血液中IgE和IgG1的合成，减缓BALF和肺组织中嗜酸性粒细胞等炎性细胞的浸润来达到治疗哮喘的目的。