白花败酱草提取物对人结直肠癌细胞SW480增殖和凋亡的影响

黄芳芳， 张双喜， 郜志诚， 朱粟意， 张相安*

(1.河南中医药大学，河南 郑州 450000；2.河南中医药大学第一附属医院肛肠科，河南 郑州 450000)

结直肠癌是一类消化道系统常见的恶性肿瘤，该病发病率正逐年上升[1]。外科手术、放疗和化疗仍是目前治疗结直肠癌的主要手段。临床上常用的化疗药物会引起机体产生较大的不良反应，给患者造成严重的危害[2-3]。因此寻求新的治疗药物或方法在癌症的治疗和预后中显得尤为重要。采用无毒高效的中药用于癌症的治疗已受到广大学者的广泛关注[4]。白花败酱草PatriniavillosaJuss是一种败酱科草本植物，具有清热解毒、活血化瘀、利尿排脓、镇心安神等功效，临床上常用于胃肠炎等疾病的治疗[5]，其抗癌作用的研究日益增多[6]。通过白花败酱草对小鼠黑素瘤B16细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞和小鼠淋巴细胞白血病细胞L1210干预的研究发现，白花败酱草可能通过抑制CDK4和cyclin D1的表达，阻滞细胞周期G0/G1期，减少S期细胞数量，最终导致增殖抑制作用，诱导细胞凋亡，起到抗肿瘤作用[7]。Notch信号通路参与正常细胞及癌细胞增殖、分化、凋亡等多种过程，且与多种肿瘤的发生和发展密切相关[8-9]。目前研究显示白花败酱草对结直肠癌细胞具有抑制作用[10-11]，但其是否通过调控Notch信号通路起到抗癌作用的研究鲜有报道。本实验通过白花败酱草干预人结直肠癌SW480细胞，观察其对SW480细胞增殖、凋亡及Notch信号通路的影响，探讨其作用机制，为白花败酱草临床上用于结直肠癌的治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 白花败酱草购自河南中医药大学，经河南中医药大学第一临床医学院张相安教授鉴定为败酱科败酱属类植物白花败酱草PatriniavillosaJuss，选取部位为根部。顺铂注射液购自江苏豪森药业股份有限公司(批号20171003)。人结直肠癌细胞株SW480购自美国ATCC细胞库。RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司(批号20161205)；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司(批号20171123)；胰蛋白酶购自美国HyClone公司(批号20170812)；噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)购自美国Sigma公司(批号20170916)；二甲基亚砜(Dimethyl sulphoxide，DMSO)购自上海碧云天生物技术有限公司(批号20170625)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自日本TaKaRa公司(批号20170811)。Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein，Bax)抗体(批号20170816)、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved caspase-3)(批号20170820)抗体、辣根酶标记的二抗(批号20170715)均购自美国Santa Cruz公司；BCA蛋白定量试剂盒(批号20170816)、ECL发光检测试剂盒(批号20170913)、SYBR Green Gene Expression Assay(批号20161021)购自宝生物工程(大连)有限公司；RNA提取试剂盒(批号20170611)、cDNA逆转录试剂盒(批号20161124)购自美国Thermo公司。

1.2 白花败酱草水提液的制备 取100 g白花败酱草进行粉碎处理，用蒸馏水(10倍体积)浸泡3 h，煮沸提取收集药液，药渣再次煮沸后收集药液，合并两次收集的药液，经减压浓缩，真空干燥后，得到白花败酱草提取物干粉，经河南中医药大学第一附属医院药理药效实验中心鉴定含有总皂荚61.82%、总黄酮8.71%，保存在4 ℃冰箱中，使用时以完全培养基稀释成所需质量浓度。

1.3 细胞培养 人结直肠癌SW480细胞复苏后，以RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)重悬，接种于培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中进行培养，根据细胞生长状态更换新鲜培养基，待细胞生长汇合度至80%时，用0.25%胰蛋白酶进行消化传代，细胞传至2～3代后用于后续实验。

1.4 MTT法检测细胞增殖情况 将处于对数期的SW480细胞接种于96孔板中，接种密度为每孔5×104个，置于37 ℃常规培养箱中进行培养，贴壁后加不同质量浓度白花败酱草提取物进行干预。将细胞分为空白对照组、白花败酱草治疗组(终质量浓度分别为0.5、1、2 mg/mL)[11]和顺铂组(终质量浓度为5 μg/mL)，置培养箱中继续培养。于24、48、72 h后，每孔细胞中加入20 μL MTT溶液，孵育4 h后弃上清，再分别向细胞中加入100 μL二甲基亚砜，置震荡仪上混匀，待沉淀完全溶解后，酶标仪490 nm处检测每组细胞光密度值(OD值)，计算各组细胞增殖抑制率，公式为细胞增殖抑制率=(1-实验组细胞OD值/对照组细胞OD值)×100%。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 取空白对照组和白花败酱草治疗组(质量浓度分别为0.5、1、2 mg/mL)以及顺铂组细胞，相应处理后48 h终止培养，用胰蛋白酶消化收集细胞，分别制成单细胞悬液，将待测细胞浓度调整为5×105个/mL。取1 mL上述细胞悬液，4 ℃、1 000 r/min离心10 min，去上清，以结合缓冲液悬浮细胞，加入5 μL碘化丙啶(PI)轻轻混匀，再加入5 μL膜联蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)避光室温反应15 min，流式细胞仪上机检测各组细胞凋亡情况。

1.6 Western blot检测细胞中cleaved caspase-3、Bax蛋白表达 将对数期SW480细胞接种于培养皿中，于37 ℃培养箱中培养24 h，换液后加入终质量浓度为0、0.5、1、2 mg/mL的白花败酱草提取物，顺铂组加入终质量浓度为5 μg/mL的顺铂药液。继续培养24 h，收集各组细胞，分别加入蛋白裂解液，提取细胞中可溶性蛋白，采用BCA试剂盒定量后，加入上样缓冲液，在沸水中水浴10 min变性，取质量为120 μg变性蛋白，以10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，待所有条带均匀分开后停止电泳。采用半干法将其转移至PVDF膜上，置于含5%脱脂奶粉的封闭液中封闭4 h，分别加入cleaved caspase-3一抗(1∶500稀释)、Bax(1∶1 000稀释)进行杂交，置摇床上4 ℃过夜孵育，以TBS洗膜3次，每次10 min，加入二抗(1∶1 500稀释)进行杂交，室温孵育2 h，以TBS洗涤3次后ECL化学发光，成像仪中曝光拍照，采用凝胶成像系统分析各条带，以GAPDH为内参蛋白，统计cleaved caspase-3、Bax蛋白相对表达。

1.7 RT-qPCR检测细胞中Notch1、Hes-1 mRNA表达 按照上述处理方法，用0、0.5、1、2 mg/mL的白花败酱草提取物干预SW480细胞48 h后，顺铂组以终质量浓度为5 μg/mL的药液干预细胞48 h，按照RNA提取试剂盒提取各组细胞中RNA，用RNase-free ddH2O溶解RNA，经质量浓度和纯度检测后，以合格的RNA为模板采用逆转录试剂盒合成cDNA，采用SYBR Green Gene Expression Assay进行RT-qPCR反应，反应结束后分析熔链曲线，确定无非特异性扩增，以GAPDH为内参，用相对定量2-△△CT计算各组细胞中Notch1、Hes-1 mRNA表达量。GAPDH正向引物5′-GTCATCCATGACAACTTTGG-3′，反向引物5′-GAGCTTG ACAAAGTGGTCGT-3′；Nocth1正向引物5′-GCGGCTCACGG TCTCACTC-3′；反向引物5′-TCCGCGGCTCCATC GTCTACC-3′；Hes-1正向引物 5′-ACGTGCGAGGG GCGTTAATA-3′，反向引物5′-GGGGTAGGTCATGGCAT TGA-3′。

2 结果

2.1 白花败酱草对SW480细胞增殖的影响 经0、0.5、1、2 mg/mL 白花败酱草提取物干预SW480细胞24、48、72 h后，MTT法检测对细胞增殖的影响，结果如表1所示，可知随着白花败酱草提取物质量浓度的增加，细胞增殖抑制率随之升高(P<0.05)。

表1 不同质量浓度的白花败酱草对SW480细胞增殖的影响

2.2 白花败酱草对SW480细胞凋亡的影响 用0、0.5、1、2 mg/mL 白花败酱草提取物处理SW480细胞48 h后，用流式细胞仪检测细胞凋亡，结果如图1和表2所示，与空白对照(0 mg/mL)组比较，0.5、1、2 mg/mL组细胞凋亡率升高(P<0.05)；与0.5 mg/mL组比较，1、2 mg/mL组细胞凋亡率升高(P<0.05)；与1 mg/mL组比较，2 mg/mL组细胞凋亡率升高(P<0.05)。

图1 流式细胞检测各组细胞凋亡情况

表2 白花败酱草对SW480细胞凋亡的影响

2.3 白花败酱草对SW480细胞中cleaved caspase-3、Bax蛋白表达的影响 Western blot检测结果如图2和表3所示，与空白对照(0 mg/mL)组比较，0.5、1、2 mg/mL组cleaved caspase-3和Bax蛋白表达升高(P<0.05)；与0.5 mg/mL组比较，1、2 mg/mL组cleaved caspase-3和Bax蛋白表达升高(P<0.05)；与1 mg/mL组比较，2 mg/mL组cleaved caspase-3和Bax蛋白表达升高(P<0.05)。

图2 Western blot检测SW480细胞中cleaved caspase-3和Bax蛋白表达

表3 白花败酱草对SW480细胞中cleaved caspase-3和Bax蛋白表达的影响

2.4 白花败酱草对SW480细胞中Notch1、Hes-1 mRNA表达的影响 如表4所示，与空白对照(0 mg/mL)组比较，0.5、1、2 mg/mL组Notch1、Hes-1 mRNA表达降低(P<0.05)；与0.5 mg/mL组比较，1、2 mg/mL组Notch1、Hes-1 mRNA表达降低(P<0.05)；与1 mg/mL组比较，2 mg/mL组Notch1、Hes-1 mRNA表达降低(P<0.05)。

表4 白花败酱草对SW480细胞中Notch1、Hes-1基因表达的影响

3 讨论

近年来研究发现白花败酱草对多种肿瘤细胞具有明显抑制作用。白花败酱草广泛应用于消化、呼吸、血液等恶 性肿瘤的治疗，且在大肠癌的治疗中取得较好治疗效果[12]。人宫颈癌Hela细胞体外研究中，白花败酱草通过激活凋亡关键蛋白caspase-3，诱导Hela细胞凋亡，发挥抗宫颈癌作用[13]。在人胃癌、肝癌细胞中有同样的发现，白花败酱草通过活化caspase-3抑制细胞生长[14-15]。目前治疗肿瘤研究中诱导肿瘤细胞凋亡成为了新的热点。细胞凋亡是受多种基因调控，具有典型的形态和生化特征的一种生物学行为，且受天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspases)家族和Bcl-2家族基因调控[16]。caspases能够参与细胞生长、分化、细胞因子成熟及细胞凋亡，其中caspase-3是凋亡通路中关键效应分子，是细胞凋亡的执行者[17]。Bcl-2家族中的Bax基因是一种促凋亡基因，其过表达可促使细胞趋于死亡[18]。本实验结果显示，白花败酱草能够抑制人结直肠癌SW480细胞的增殖，随着白花败酱草质量浓度的增高，抑制作用增强；通过流式细胞仪检测，白花败酱草可诱导SW480细胞凋亡，同样呈质量浓度依赖效应。此外本实验还通过Western blot检测细胞中cleaved caspase-3和Bax表达变化，发现白花败酱草干预SW480细胞后两者表达升高，白花败酱草可诱导caspase-3激活，促进Bax表达，间接使SW480细胞发生凋亡。以上结果表明白花败酱草通过抑制结直肠癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。

在加味薏苡附子败酱散对肝癌细胞株Bel-7404的影响实验中，发现含药血清可通过下调Notch信号通路及靶基因抑制Bel-7404细胞增殖[19]。Notch信号通路参与细胞之间信息传递及细胞生长、分化等过程，是细胞信号网络的重要通路[20]。近年来研究表明，Notch信号通路的激活可促进肿瘤干细胞增殖导致肠肿瘤的形成[21]。Notch信号通路中关键效应分子Notch1在结直肠瘤中高表达，能够阻断结直肠黏膜杯细胞的终末分化，促使未分化的细胞向恶性转化，发挥致癌作用[22]。体外细胞实验发现过表达Notch1可显著促进结直肠癌细胞的集落形成、增殖及肿块生成[23]。本实验通过白花败酱草对SW480细胞干预后，检测Notch信号通路效应分子Notch1基因及靶基因Hes-1的表达，显示Notch1、Hes-1 mRNA表达降低，提示白花败酱草可抑制Notch信号通路的激活。

本研究使用白花败酱草提取物对结直肠癌细胞体外干预，发现其对结直肠癌细胞体外增殖抑制作用明显，表现出一定的质量浓度和时间依赖关系；且能够诱导结直肠癌细胞凋亡，上调与凋亡相关蛋白Bax的表达，激活caspase-3。白花败酱草提取物可降低Notch1及Hes-1 mRNA表达，影响Notch信号通路的激活，达到抑制结直肠癌细胞的作用。白花败酱草能否在体内抑制结直肠癌的发生、转移需进行进一步临床实验研究。中药白花败酱草提取物对结直肠癌细胞中信号通路的影响将为治疗结直肠癌提供新的作用靶点及思路。