藤梨根制剂抑制白介素8诱导的血管内皮细胞迁移的分子机制

杜英杰， 赵印涛， 张雨涵， 李晓军， 吴金洋

(承德医学院中医学院，河北 承德 067000)

随着人类饮食结构的改变，心血管疾病逐渐成为威胁人类健康的主要疾病。动脉粥样硬化是导致心血管疾病发生的最关键因素[1]。新生血管形成是粥样硬化斑块特征之一，可引发易损斑块的发展，增加斑块破裂的风险[2]。血管内皮细胞迁移是血管新生过程的关键环节[3]，抑制内皮细胞的迁移和侵袭可有效抑制新血管的生成。藤梨根是猕猴桃科猕猴属植物硬毛中华猕猴桃的根，性味苦、寒，具有清热、解毒、活血等功效。研究显示，藤梨根制剂可抑制结直肠癌[4]、胃癌[5]等肿瘤细胞的迁移和侵袭，具有较好的抗肿瘤转移作用。但目前，还未见藤梨根制剂影响血管内皮细胞迁移的相关报道。白介素8(interleukin 8，IL-8)是趋化性细胞因子，主要由单核巨噬细胞和内皮细胞产生，参与炎症和免疫反应[6]。近年来研究显示，IL-8也是介导内皮细胞迁移的重要因子[7]。因此，本研究采用IL-8诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，探讨藤梨根制剂对HUVECs迁移的影响和分子机制。

1 材料

人脐静脉内皮细胞HUVECs，批号20181215，中国科学院上海细胞库。藤梨根、水杨梅、茯苓等药材，河北安国东方药城。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，批号20181211，浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM培养基，批号20190116，北京索莱宝科技有限公司；四甲基噻唑蓝(methylthiazoletrazolium，MTT)(批号298-93-1)和胰蛋白酶(批号20180629)，美国Sigma公司；LipofectamineTM2000试剂盒，批号20190111，美国Invitrogen公司；鼠抗人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(批号20181027)、单核细胞趋化因子-1(monocyte chemotactic factor-1，MCP-1)(批号20181119)单克隆抗体，福州迈新生物技术开发有限公司；趋化因子受体1(chemokine receptor 1，CXCR1)(批号20181105)和趋化因子受体2(chemokine receptor 2，CXCR2)(批号20181219)多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司；二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白检测试剂盒，批号20190216，上海碧云天生物技术有限公司；CXCR1、CXCR2过表达载体及对照，上海吉凯基因医学科技股份有限公司。YDS-20-50液氮罐，新乡市鑫鸿低温容器制造有限公司；超净工作台，四川天利和科技有限公司；CCL-170B-8-UV型ESCO CO2培养箱，北京中豪莱伯科技发有限公司；FlexA-200全自动酶标仪，杭州奥盛仪器有限公司；Transwell小室，美国Millipore公司；IX70倒置显微镜，日本Olympus公司；165-8033小型垂直电泳仪、ChemiDoc Touch成像系统，美国Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 藤梨根制剂制备 称取藤梨根30 g、水杨梅根30 g、虎杖根30 g、茯苓20 g、党参20 g、白术15 g、薏苡仁30 g，甘草10 g，粉碎并过200目筛，加1 000 mL水煎煮2 h，抽滤，滤液经旋转蒸发浓缩至20 mL左右，置于真空干燥箱中干燥，得到干燥产物59.7 g。精密称取10 mg，DMEM培养基溶解并定容至10 mL，配成1 g/L母液，0.45 μL滤头过滤除菌，4 ℃冰箱保存备用。实验时，培养基稀释至所需浓度。

2.2 HUVECs培养 从液氮罐中取出装有HUVECs的冻存管，迅速置于37 ℃水浴中融化，超净工作台内将细胞悬液转移至15 mL离心管中，加入适量预冷磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)，混匀，1 000 r/min离心5 min，吸弃上清，沉淀再次加入适量PBS清洗细胞，吸弃上清，加入含10% FBS的DMEM培养基并转移至细胞培养瓶中，置于37 ℃、 5%CO2、相对湿度97%的培养箱中培养。每2～3 d更换1次新鲜培养基。当细胞融合至80%～90%时，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3的比例传代培养。

2.3 细胞分组 HUVECs分为对照组、IL-8组、不同剂量藤梨根制剂+IL-8组，对照组细胞正常培养，IL-8组细胞用含100 ng/mL[8]的IL-8诱导，不同剂量藤梨根制剂+IL-8组分别用含3.2、16、80、160 mg/L[9]藤梨根制剂及100 ng/mL IL-8的培养基共同作用。

2.4 MTT检测藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs存活率的影响 对数生长期的HUVECs接种于96孔板中，每孔5×103个细胞。培养2 h后，按照“2.3”项下方法分组处理。每组设置3个复孔。继续培养24 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)继续孵育4 h。吸弃培养基，每孔加入150 μL二甲基亚砜，反应5 min，结晶紫溶解后混匀，全自动酶标仪490 nm处测定每孔的吸光度值(absorbance，A)。实验重复3次。

2.5 Transwell检测藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs迁移和侵袭 对数生长期的HUVECs用不含FBS的DMEM培养基调整浓度为5×104个/mL，将带有8 μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室(美国Millipore公司)置于24孔板中，上室加入100 μL细胞悬液，下室加入500 μL含10% FBS的DMEM培养基。培养2 h后，上室细胞分为对照组、IL-8组、不同剂量藤梨根制剂+IL-8组，其中对照组细胞正常培养，IL-8组细胞用含100 ng/mL的IL-8的培养基培养，不同剂量藤梨根制剂+IL-8组分别用含3.2、16、80 mg/L藤梨根制剂与100 ng/mL IL-8的培养基共同培养；下室均为500 μL含10% FBS的培养基，每组设置3个复孔，继续培养24 h后吸弃培养基，取出小室，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，0.4%结晶紫室温染色15 min，PBS清洗至无色，自然晾干后置于倒置显微镜观察，随机选取5个视野，对穿膜细胞计数。预冷Matrigel基质胶用不含FBS的DMEM培养基以1∶8比例稀释后铺于Transwell上室，自然晾干，然后加入100 μL细胞悬液，后续步骤同细胞迁移实验。实验重复3次。

2.6 细胞划痕实验检测藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs划痕愈合率 对数生长期的HUVECs接种于6孔板中，每孔1×105个细胞。培养2 h后，用移液器在6孔板上划两条直线，预冷PBS洗去刮下的脱落细胞。按“2.3”项下方法分组处理，每组设置3个复孔。继续培养0、24 h后，在显微镜下观察，随机选取5个位置测量细胞划痕宽度，Image J 软件计算划痕愈合率，公式为划痕愈合率=(1-24 h空白区域面积/0 h空白区域面积)×100%。实验重复3次。

2.7 蛋白印迹(Western blot)法检测藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs中VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表达 加入含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，提取细胞中总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白，100 ℃煮沸5 min，变性后每孔取30 μg蛋白行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转至聚偏乙烯二氟膜，于5%脱脂牛奶中封闭1 h，分别置于VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2抗体孵育液中，4 ℃孵育过夜。洗膜后，置于辣根过氧化酶标记的二抗孵育液中，室温孵育1 h，滴加化学发光试剂ECL避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。以β-actin为内参，Image J 软件分析蛋白条带灰度值。

2.8 过表达CXCR1/2对藤梨根制剂干预的HUVECs迁移、侵袭及VEGF和MCP-1蛋白表达的影响 对数生长期的HUVECs接种于6孔板中，每孔1×105个细胞，当细胞融合至60%时，更换不含FBS的培养基。参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书，分别转染CXCR1过表达载体(pcDNA-CXCR1)、CXCR2过表达载体(pcDNA-CXCR2)、共转染CXCR1与CXCR2过表达载体(pcDNA-CXCR1/2)及阴性对照(pcDNA)至HUVECs。转染后的细胞均用含16 mg/L藤梨根制剂与100 ng/mL IL-8的培养基共同作用，并依次记为藤梨根制剂+IL-8+pcDNA-CXCR1组、藤梨根制剂+IL-8+pcDNA-CXCR2组、藤梨根制剂+IL-8+pcDNA-CXCR1/2组和藤梨根制剂+IL-8+pcDNA组。分别采用Transwell、细胞划痕实验、Western blot检测各组细胞迁移和侵袭、划痕愈合率及细胞中VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表达，方法同“2.5”“2.6”和“2.7”项。每组设置3个复孔，实验重复3次。

3 结果

3.1 藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs存活的影响 与对照组比较，IL-8组细胞存活率无明显变化(P>0.05)；与IL-8组比较，3.2、16、80 mg/L藤梨根制剂+IL-8组细胞存活率无统计学意义(P>0.05)，160 mg/L藤梨根制剂+IL-8组细胞存活率降低(P<0.05)，见表1。

表1 藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs存活的影响

3.2 藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs迁移和侵袭 与对照组比较，IL-8组细胞迁移和侵袭数、细胞愈合率升高(P<0.05)；与IL-8组比较，不同剂量藤梨根制剂+IL-8组细胞迁移和侵袭数、细胞愈合率降低(P<0.05)，见表2、图1。

表2 藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs迁移和侵袭的影响

注：A为Transwell检测细胞迁移和侵袭，B为划痕实验检测细胞迁移。图1 藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs迁移和侵袭的影响

3.3 藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs中VEGF和MCP-1表达的影响 与对照组比较，IL-8组细胞VEGF和MCP-1蛋白表达升高(P<0.05)；与IL-8组比较，不同剂量藤梨根制剂+IL-8组细胞VEGF和MCP-1蛋白表达降低(P<0.05)。见图2、表3。

图2 Western blot检测HUVECs中VEGF、MCP-1蛋白表达

表3 藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs中VEGF、MCP-1蛋白表达的影响

3.4 藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs中IL-8受体CXCR1/2表达的影响 与对照组比较，IL-8组细胞CXCR1和CXCR2蛋白表达升高(P<0.05)；与IL-8组比较，不同剂量藤梨根制剂+IL-8组细胞CXCR1和CXCR2蛋白表达降低(P<0.05)。见图3、表4。

图3 Western blot检测HUVECs中CXCR1和CXCR2蛋白的表达

表4 藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs中CXCR1和CXCR2蛋白表达的影响

3.5 过表达CXCR1/2部分逆转藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs迁移和侵袭的抑制作用 与藤梨根制剂+IL-8+pcDNA组比较，藤梨根制剂+IL-8+pcDNA-CXCR1组、藤梨根制剂+IL-8+pcDNA-CXCR2组细胞CXCR1、CXCR2蛋白表达升高(P<0.05)，细胞迁移和侵袭数、细胞愈合率升高(P<0.05)；与藤梨根制剂+IL-8+pcDNA-CXCR1组、藤梨根制剂+IL-8+pcDNA-CXCR2组比较，藤梨根制剂+IL-8+pcDNA-CXCR1/2组细胞CXCR1、CXCR2蛋白表达升高(P<0.05)，细胞迁移和侵袭数、细胞愈合率升高(P<0.05)。见图4～5、表5。

图4 Western blot检测HUVECs中CXCR1、CXCR2蛋白表达

注：A为Transwell检测细胞迁移和侵袭，B：划痕实验检测细胞迁移。图5 过表达CXCR1/2逆转藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs迁移和侵袭的影响

表5 过表达CXCR1/2逆转藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs中CXCR1、CXCR2蛋白表达及细胞迁移和侵袭的影响

3.6 过表达CXCR1/2逆转藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs中VEGF、MCP-1蛋白的抑制作用 与藤梨根制剂+IL-8+pcDNA组比较，藤梨根制剂+IL-8+pcDNA-CXCR1组、藤梨根制剂+IL-8+pcDNA-CXCR2组细胞VEGF、MCP-1蛋白表达升高(P<0.05)；与藤梨根制剂+IL-8+pcDNA-CXCR1组、藤梨根制剂+IL-8+pcDNA-CXCR2组比较，藤梨根制剂+IL-8+pcDNA-CXCR1/2组细胞VEGF、MCP-1蛋白表达升高(P<0.05)。见图6、表6。

图6 Western blot检测HUVECs中VEGF、MCP-1蛋白表达

4 讨论

IL-8属于趋化因子家族CXC亚家族成员，与细胞上的CXCR受体具有高度亲和力。CXCR受体是一种G蛋白偶合体。内皮细胞可同时表达CXCR1和CXCR2两种受体，这两种受体均可与IL-8特异性结合[10]。IL-8通过激活CXCR1和CXCR2受体后，引起细胞收缩及细胞与细胞间隙增加，提高细胞基底膜通透性，促进血管生成[11]。VEGF是目前公认的功能最强的新生血管生成促进因子，可作用于血管内皮细胞膜上的相应受体，通过一系列信号传导促进内皮细胞分裂、增殖和迁移[12]。MCP-1属于CC趋化因子家族成员，主要参与机体免疫调节、肿瘤生长及血脑屏障[13]。研究显示，MCP-1通过趋化因子受体2诱导血管平滑肌细胞迁移[14]。本研究发现，IL-8诱导HUVECs后，细胞迁移和侵袭数、划痕愈合率升高，与相关报道结果一致，提示IL-8促进了HUVECs迁移和侵袭。本研究还显示，IL-8诱导HUVECs后，细胞中VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表达增加，提示IL-8可能通过与CXCR1和CXCR2受体结合激活其表达以及上调细胞中VEGF和MCP-1表达促进HUVECs迁移。

近年来，我国传统中药具有多治疗靶点、药性温和、毒副作用低等优点，成为疾病治疗研究的热点。藤梨根制剂是以我国特有种中华猕猴桃的根为君药，以水杨梅根、虎杖根为臣药，加之党参、白术等组成的祛除解毒、扶助正气的复方药。目前，对藤梨根制剂功效的研究多为抗肿瘤作用研究。如复方藤梨根制剂可能通过下调乙酰肝素酶表达来抑制胃癌细胞的远处转移，发挥抗胃癌作用[15]。藤梨根制剂可抑制小鼠体内结肠癌细胞肺转移[16]，其联合伊立替康与卡培他滨可改善晚期结肠癌肝转移患者生存质量和免疫功能，减轻化疗毒副反应[17]。藤梨根制剂可能通过下调卵巢癌A2708细胞MMP-2、MMP-9表达及上调TIMP-1表达抑制卵巢癌A2780细胞增殖、迁移及侵袭[18]。复方藤梨根制剂能抑制肿瘤生长，减少CT26瘤体中MVD，具有抗肿瘤血管生成作用[19]。但藤梨根制剂能否抑制内皮细胞的迁移还未见相关研究。

本研究显示，藤梨根制剂在一定浓度范围内对IL-8诱导HUVECs活性无显著影响，而浓度升高时可抑制HUVECs存活。选择对HUVECs活性无显著影响浓度的藤梨根制剂，观察其对IL-8诱导HUVECs迁移及VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表达的影响，结果显示，藤梨根制剂作用后，IL-8诱导HUVECs迁移和侵袭数、划痕愈合率及VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表达均降低，提示藤梨根制剂可能通过抑制VEGF、MCP-1、CXCR1和CXCR2蛋白表达抑制IL-8诱导HUVECs迁移。本研究还显示，过表达CXCR1或CXCR2可逆转藤梨根制剂对IL-8诱导HUVECs迁移的抑制作用，且同时过表达CXCR1和CXCR2的逆转作用更强，进一步说明藤梨根制剂通过抑制CXCR1和CXCR2蛋白表达来抑制IL-8诱导HUVECs迁移。

综上所述，藤梨根制剂可能通过抑制CXCR1和CXCR2蛋白表达来抑制血管内皮细胞的迁移，为动脉粥样硬化的治疗提供了新途径。