基于偏最小二乘回归法分析诃子对溃疡性结肠炎“肺肠同治”的谱效关系

王 巍， 张 强， 杜春洁， 鞠成国

(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性肠道炎症性疾病，临床主要表现为黏液脓血便、腹泻、腹痛及里急后重等，与中医“肠澼”相对应。其病因至今尚不完全清楚，目前认为主要与饮食和生活方式不规律以致肠道菌群失调、黏液和上皮屏障功能缺陷有关[1]。现代临床治疗多以水杨酸类、糖皮质激素以及免疫抑制剂等药物联用，但存在疗效不稳定、肝肾毒性、药物依赖性等问题[2]，因此寻找安全有效的中医药疗法成为当务之急。中医理论认为本病病位在大肠，病在血分，气血凝滞，病久及肺[3]，因此目前从肺肠合治法论治溃疡性结肠炎研究较多[4]。诃子收载于《中国药典》2020 年版一部，为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz.及绒毛诃子TerminaliachebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果实，其味苦、酸、涩，性平，归肺、大肠经，具有涩肠止泻、敛肺止咳、降火利咽的功效[5]。由于诃子主归肺与大肠经，传统医学常用其治疗“肠澼”，本课题组前期对其治疗溃疡性结肠炎的药效学进行研究，结果表明诃子水提物可显著改善溃疡性结肠炎模型动物症状。本实验在前期研究基础上，建立诃子水提物HPLC指纹图谱，以偏最小二乘(partial least squares，PLS)回归法分析其“肺肠同治”的谱效关系，为诃子对溃疡性结肠炎“肺肠同治”药效物质研究奠定基础。

1 材料

1.1 药材 10批诃子经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定，均为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz.的干燥成熟果实，具体信息见表1。

表1 样品信息

1.2 动物 SPF级昆明小鼠，雄性，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证号 SCXK(辽)2015-0001，体质量(20±2)g。

1.3 试剂与药物 小鼠白细胞介素10(IL-10)(批号20171014GP)、白细胞介素1β(IL-1β)(批号20171014HS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)(批号20171014JA)、髓过氧化物酶(MPO)(批号20170328CT)试剂盒均购自上海朗顿生物科技有限公司；葡聚糖硫酸钠(DSS)(批号9011-18-1)，购自大连美仑生物技术有限公司；没食子酸(批号MUST-13040103，纯度≥98%)、鞣花酸(批号MUST-14031010，纯度≥98%)对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司；诃黎勒酸(批号PRF8112302，纯度≥98%)、诃子酸(批号PRF8071201，纯度≥98%)对照品均购自成都普瑞法科技开发有限公司。甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，购自天津科密欧化学试剂有限公司；水为超纯水。

1.4 仪器 安捷伦1100高效液相色谱系统(美国 Agilent公司)；FSH-2A可调高速匀浆机(常州市国旺仪器制造有限公司)；Multiskan Mk 3酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Fresco台式高速冷冻离心机(德国Heraeus公司)；FA1004B分析天平(上海精密科学仪器有限公司)。

2 方法

2.1 药效实验

2.1.1 诃子水提液制备 取各批药材，砸取果肉，粉碎，称取适量，加10倍量水浸泡0.5 h，加热回流提取3次，每次1 h，滤过，合并滤液，预留适量滤液，供HPLC指纹图谱用；剩余滤液分别浓缩成质量浓度为0.13 g/mL的溶液，作为给药溶液(以2020年版《中国药典》所载诃子最大服用量按小鼠体表系数换算方法折算)备用[6]。

2.1.2 动物分组、造模及给药 按随机对照原则将小鼠分为空白组、模型组及诃子给药组(2.6 g/kg，S1～S10)，每组10只。除空白组外，其余各组小鼠每日自由饮用2.5% DSS水溶液，空白组自由饮用纯净水，连续4 d，以小鼠毛色晦暗、腹泻及聚堆现象明显、粪便隐血测试阳性为造模成功[7]。实验第5天，各组小鼠均自由饮用纯净水，然后诃子组每天按0.4 mL/20 g剂量灌胃给药溶液，空白组、模型组小鼠灌胃同等剂量纯净水，连续7 d。

2.1.3 指标检测 末次给药后，各组小鼠禁食不禁水24 h，脱颈处死，剖开腹腔及胸腔，剥离结肠和肺，生理盐水冲洗血污，吸水纸上吸掉生理盐水，称定质量，加10倍量生理盐水充分匀浆，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，采用ELISA法对组织匀浆中IL-10、IL-1β、TNF-α、MPO水平进行测定[6-7]。

2.2 HPLC指纹图谱建立

2.2.1 供试品溶液制备 取“2.1.1”项下预留诃子水提液30 mL回收溶剂，70%甲醇复溶，转移至25 mL量瓶，定容，再精密吸取1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，吸取适量，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取没食子酸、诃黎勒酸、诃子酸、鞣花酸对照品适量，甲醇制成分别含四者0.022 4、0.157 0、0.119 0、0.035 1 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 色谱条件 Diamonsil Plus C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脱(0～8 min，95.0%～90.0%B；8～15 min，90.0%～75.0%B；15～25 min，75.0% B；25～30 min，75.0%～70.0% B；30～50 min，70.0%～55.0%B；50～55 min，55.0%B)；体积流量1.0 mL/min；检测波长270 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

3 结果

3.1 小鼠一般体征 造模后，小鼠毛色晦暗，伴有炸毛、聚堆现象，腹泻明显，体质量下降，粪便隐血检测呈阳性，诃子干预后上述现象均好转。

3.2 诃子对小鼠肺肠组织中细胞因子的影响 模型组小鼠肺与结肠IL-10水平低于空白组，IL-1β、TNF-α、MPO水平均高于空白组；与模型组比较，诃子组IL-10水平升高，IL-1β、TNF-α、MPO水平降低，见表2。

表2 诃子对小鼠结肠与肺IL-10、IL-1β、TNF-α、MPO水平的影响

3.3 HPLC指纹图谱建立

3.3.1 图谱生成 取“2.2.1”项下供试品溶液，在“2.2.3”项色谱条件下测定，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A版)进行共有峰匹配，得到指纹图谱(图1)，对各色谱峰进行平滑、去噪、峰对齐后，生成对照指纹图谱(图2)，共标记32个共有峰。取“2.2.2”项下对照品溶液，在“2.2.3”项色谱条件下测定，与指纹图谱对比，确定3号峰为没食子酸，27号峰为诃黎勒酸，31号峰为诃子酸，32号峰为鞣花酸(图3)，相似度见表3，共有峰峰面积见表4。

图1 10批样品HPLC指纹图谱

图2 10批样品对照图谱

图3 对照品色谱图

表3 10批样品指纹图谱相似度

表4 10批样品共有峰峰面积

3.3.2 方法学考察 取供试品溶液(S1)，在“2.2.3”项色谱条件下进样6次，测得各共有峰相对保留时间RSD<0.8%，共有峰峰面积RSD<1.4%，色谱图相似度>0.99，表明仪器精密度良好；取供试品溶液(S1)，于0、2、4、8、12、16 h在“2.2.3”项色谱条件下进样，测得各共有峰相对保留时间RSD<0.8%，共有峰面积RSD<1.2%，色谱图相似度>0.99，表明溶液在16 h内稳定性良好；取药材粉末(S1)6份，每份0.1 g，按“2.1.1”及“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.3”项下色谱条件进样，计算各共有峰相对保留时间RSD<0.8%，共有峰面积RSD<1.2%，色谱图相似度>0.98，表明该方法重复性良好。

3.3.3 谱效关系分析 以HPLC指纹图谱中32个共有峰的峰面积为自变量(X)，编号为X1～X32，IL-10、IL-1β、TNF-α、MPO水平为因变量(Y)，将相关数据代入MINITAB 19 软件，建立偏最小二乘回归方程，得到肺与结肠组织中4种细胞因子与共有峰之间的回归系数值，见表5。由于药效的产生是对IL-10、IL-1β、TNF-α、MPO水平综合调节作用的结果[8-10]，故进一步以四者回归系数的平均值来评价各色谱峰与溃疡性结肠炎治疗效果的相关度，结果见表5、图4，可知与肺和结肠均呈正相关的色谱峰有8个，为峰1、8、9、10、19、20、27、32；均呈较大负相关的峰有5个，为峰3、12、13、15、26。

表5 各指标回归系数值

图4 结肠与肺的平均回归系数

4 讨论

将供试品溶液在200～400 nm进行全波长扫描，结果显示在220、270 nm处呈现最大吸收，其中270 nm处诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸均呈较大吸收，并且为酚酸类成分测定所常用，因此本实验采用270 nm作为检测波长。

中药具有多成分、多靶点的特点，其药效的发挥是多种成分相互之间共同作用的结果。实践证明，某些化学成分在中药中含量较低，但其生物学活性却很强，因此本实验在建立指纹图谱的过程中，将检测到的所有色谱峰进行共有峰匹配，共得到32个共有峰。进一步地，将32个共有峰与药效结果进行关联，以确保最大程度地反应成分与药效之间的关系。

溃疡性结肠炎的临床症状主要为腹泻、便血，本实验采用DSS诱导制备小鼠溃疡性结肠炎模型，动物体质量下降、聚堆明显且便血严重，与临床症状相符。溃疡性结肠炎模型小鼠肺与结肠组织中促炎因子和抑炎因子失调，肠道内环境紊乱，炎症加重[11]；IL-1β、TNF-α为常见的促炎因子，IL-10为抑炎因子，MPO 为评价炎症程度的重要指标[12]。经诃子治疗后，所选取的4项指标治疗组与模型组均具有显著性差异，表明诃子改善溃疡性结肠炎症状的作用与下调IL-1β、TNF-α，促进IL-10产生及抑制MPO活性有关。

中医理论认为“肺与大肠相表里”，肺与肠相互络属，病理上相互影响，肠病日久，必会累及于肺[13]。“肺气虚，大肠亦虚，而不能禁固，时时欲去，后重不已……”其指出肺气虚弱，会累及大肠固摄作用，导致里急后重[14]，因此治疗当以升肺固肠共进。本实验所造溃疡性结肠炎模型小鼠肺组织的各项炎症因子水平测定结果表明结肠病变确实影响了肺，经过诃子的治疗，既减轻了肠道炎症及腹泻症状，又修复了肺部的损伤，达到了“肺肠同治”的作用。本实验共得到4组炎症有关的药效指标数值，每组数值与共有峰面积计算回归系数，发现同一个色谱峰与不同指标具有不同的回归系数，说明某一成分对不同指标调控作用是不同的[15]，而药效的产生是化学成分对4种细胞因子综合调控的结果，因此应综合考虑某一成分对4种因子的整体调控作用，故最终选择四组回归系数的平均值来确定关联度。结果表明，色谱峰1、8、9、10、19、20、27、32与结肠和肺均呈正相关，色谱峰2与结肠呈较大正相关，色谱峰7、14、30与肺呈较大正相关，提示这12种成分应为“肺肠同治”的主要药效成分，其中27为诃黎勒酸，32为鞣花酸；色谱峰3、12、13、15、26与结肠和肺均呈较大的负相关，说明此5种成分不利于诃子对溃疡性结肠炎治疗作用的发挥。

综上所述，本实验通过偏最小二乘回归分析法建立诃子水提物指纹图谱与溃疡性结肠炎模型动物肺与结肠组织中4种细胞因子之间的谱效关系，初步得到12种化学成分可能为诃子对溃疡性结肠炎起治疗作用的主要成分，为后续诃子治疗溃疡性结肠炎的药效物质及作用机制研究提供理论基础。