生物样本中芬太尼的色谱定性与定量分析

张自伟，王怀远，张 武

（1.皖南医学院法医学院，安徽 芜湖 241002；2.颍上县公安局刑事科学技术室，安徽 颍上 236200）

芬太尼是一种高效阿片类镇痛药，其镇痛效力为吗啡的50～100倍，1963年开始应用于临床，作为一种镇痛剂主要用于治疗慢性疼痛［1］。近年来芬太尼及其衍生物滥用问题日益严重，甚至有麻醉意外中毒（死）和滥用中毒（死）的报道［2-4］。2019年5月1日起中国正式对芬太尼作为合法药物使用进行整类列管，但和芬太尼相关的案件在司法鉴定工作中仍屡屡遇到。因此，建立快速灵敏、简单易行的芬太尼定性和定量分析方法是十分必要的。生物样本中目标物的分析方法建立时应该采用适当的样品前处理方法。芬太尼的样品前处理方法经常使用的有液液萃取法、固相萃取法和化学衍生法等［5］。其中化学衍生法可以提高目标物在生物检材中的灵敏度，但是其样品前处理耗时且需要相应的衍生试剂；固相萃取法具有样品杂质干扰少的优点，但是装置相对复杂且需要相应的固相萃取小柱，实验成本高；液液萃取法具有价格低廉、装置和操作简单的优势，并且其回收率优于蛋白质萃取法［5］。综合考虑这几种样品前处理方法，液液萃取法对于生物样本中芬太尼的前处理分析最具优势。目前已报道的生物样本中芬太尼的分析方法主要包括免疫分析法［6-7］、流动注射-化学发光法（CL）［8］、高效液相色谱法（HPLC）［9］、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）［10-12］、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）［13-15］。已报道的这些方法中，免疫分析法测定步骤多、操作烦琐；流动注射-化学发光法选择性不高且重复性较差；液相色谱-质谱联用法具有灵敏度高和选择性好的优点，但仪器设备昂贵，操作复杂，不具有普遍性。高效液相色谱法和气相色谱-质谱联用法由于准确度高、精密度好等优点，最适合用于生物样本中芬太尼的检测。本研究面向日常鉴定工作的需要，首先优化实验条件建立了高效液相色谱-二极管阵列检测器法（HPLC-DAD）定性分析芬太尼，在此工作基础上，进一步建立了一种基于液液萃取-气相色谱-质谱联用法（LLE-GC-MS）定量分析生物样本中的芬太尼。色谱定性和定量分析方法具有样品前处理简单、适用范围广的优点，能够用于快速筛查和精准测量生物样本中的芬太尼。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验试剂甲醇（色谱纯，Merck公司）；乙腈（色谱纯，Merck公司）；乙醚（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸二氢钾（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；氢氧化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；无水硫酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；中性氧化铝（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；pH缓冲剂（上海仪电科学仪器股份有限公司）；pH试纸（1～14）；芬太尼标准品（1.0 mg·mL-1,美国Cerilliant公司)；超纯水（电阻率18.2 MΏ·cm）。

1.1.2 实验仪器岛津GCMS-QP2010 ultra，安捷伦HPLC 1260（DAD检测器），KH5200型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司），800型电动离心机（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂），TGL-16B高速离心机（上海安亭科学仪器厂），WH-3微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂），SHANGPING FA1004电子分析天平（上海天平仪器厂），ST3100/F酸度计［奥豪斯仪器（常州）有限公司］，ELGApurelab flex2超纯水仪（电阻率18.2 MΩ·cm，英国），Eppendorf微量加样器（20～200μL），普通冰箱，HH-420型电热恒温水温箱（绍兴博纬仪器设备有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 HPLC-DAD定性分析条件色谱柱ZORBAX SB-C18柱（4.6×150 mm，5μm），流动相为乙腈∶水（0.015 mol·L-1KH2PO4，pH=5）=40∶60，流速1 mL·min-1。检测波长205 nm，带宽2 nm；参比波长360 nm，带宽100 nm；柱温室温；进样量5μL。

1.2.2 LLE-GC-MS定性与定量分析条件

1.2.2.1 芬太尼定性分析色谱条件：色谱柱Rxi-5Sil MS柱（30.0 m×0.25 mm×0.25μm）；升温程序为100℃保持1.5 min，25℃·min-1升温速率到280℃，保持15 min。柱箱温度100℃，进样口温度250℃，流量控制方式为压力模式，总压力为72.7 kPa，柱流量1 mL·min-1。手动进样，进样量1μL。质谱条件：电离能70 eV，接口温度280℃，离子源温度230℃，四级杆温度150℃。检测器电压0.2 kV（相对于调谐结果），载气：He，流量1 mL·min-1（恒流模式）。溶剂延迟时间3 min，开始时间3.5 min，结束时间23.7 min，采集方式全扫描模式（FULL SCAN），间隔0.5 sec，扫描速度1 000，开始（m/z）50，结束（m/z）500，分流比为50∶1。采集方式选择离子监测（SIM），分流比5∶1。

1.2.2.2 芬太尼定量分析芬太尼的定量采用标准曲线法，将芬太尼标准溶液添加至空白血液中配制成浓度为1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、10 ng·mL-1、100 ng·mL-1、500 ng·mL-1的系列样品。按文中方法进行前处理和分析，采集方式选择离子监测，芬太尼m/z245。以芬太尼的浓度为横坐标（C），目标物的峰面积为纵坐标（A）绘制标准曲线，进行回归分析，得到回归方程Â=aC＋b，根据回归方程计算得到样品中芬太尼的浓度C。

1.2.3 溶液配制100.0μg·mL-1芬太尼储备液配制：移取100μL母液（1.0 mg·mL-1）用甲醇稀释到1 mL。10μg·mL-1芬太尼工作溶液：移取1 000μL 100.0μg·mL-1芬太尼储备液用甲醇稀释到10 mL。芬太尼储备液和工作溶液在4℃条件下冷藏保存，每2周重新配制。

1.2.4 生物样品血液和胃内容物的前处理方法本实验中所用的血液及胃内容物样品均由安徽省颍上县公安局合法提供，符合皖南医学院医学伦理学规定。

1.2.4.1 血液前处理移取2 mL的血液样品置于10 mL离心管中，滴加10%氢氧化钠溶液调制溶液至碱性（pH=11～12），加3 mL乙醚，涡旋2 min后，离心（转速2 000 r·min-1）2 min，取上清液于60℃水浴挥至近干。处理过的血液再用50μL甲醇复溶得到血液样品溶液。血液样品中芬太尼测试，取1μL上述血液样品溶液手动进样。

1.2.4.2 胃内容物前处理称取约1 g的胃内容物，滴加10%氢氧化钠溶液调制溶液至碱性（pH=11～12），加3 mL乙醚，涡旋2 min后，以2 000 r·min-1的转速离心2 min，取离心后的上清液加适量无水硫酸钠和中性氧化铝以除去生物样品中内源性脂肪、蛋白质、色素等，用漏斗过滤，滤液用0.45μm有机膜过滤后于60℃水浴挥至近干。残渣用200μL甲醇复溶得到胃内容物样品溶液。胃内容物中芬太尼测定时取1μL上述胃内容物样品溶液手动进样。

1.2.5 LLE-GC-MS标准曲线溶液配制将芬太尼工作溶液用甲醇稀释得到浓度分别为1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、10 ng·mL-1、100 ng·mL-1、500 ng·mL-1的芬太尼溶液；将100μg·mL-1芬太尼储备液用甲醇稀释分别得到浓度为5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1的芬太尼溶液。

1.2.6 LLE-GC-MS分析时方法学验证

1.2.6.1 芬太尼标准样品冷藏稳定性芬太尼溶液（5μg·mL-1）4℃下放置7天内进样，在建立的GC-MS条件下分析。考察芬太尼出峰时间和峰面积的变化。

1.2.6.2 特异性取1份空白血液（不含有检测目标物或检测对象的血液样本）添加10μg·mL-1的甲基苯丙胺、氯胺酮和哌替啶，按文中方法进行前处理和分析。

1.2.6.3 检出限、定量限和线性取空白血液加入芬太尼标准溶液，配制成一系列浓度的血液样品，按文中方法进行前处理和分析。信噪比≥3时对应的浓度即为本方法检出限，信噪比≥10时对应的浓度即为本方法定量限。定量限样品的精密度和准确度符合要求。

将芬太尼标准溶液添加至空白血液中配制成浓度 为1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、10 ng·mL-1、100 ng·mL-1、500 ng·mL-1的样品，按文中方法进行前处理和分析。

1.2.6.4 精密度和准确度取空白血液，配制成浓度为10μg·mL-1和100μg·mL-1的标准添加样品，每个浓度配制5个样品，连续测定3天，根据测定结果计算GC-MS方法的日内、日间精密的相对标准偏差（Relative standard deviation，RSD）值。

1.2.6.5 回收率取空白血液，配制成浓度为2 ng·mL-1、10 ng·mL-1、100 ng·mL-1的标准添加样品，按文中方法进行前处理和分析，根据标准添加结果和测定结果，计算回收率。

1.3 统计学方法用SPSS 26.0统计软件对所得结果数据进行分析，由均数±标准差表示处理后的数据。采用一元回归分析建立芬太尼的峰面积与浓度之间的回归方程，对回归方程进行检验。

2 结 果

2.1 LLE-GC-MS分析时提取pH和提取溶剂的选择芬太尼是一种碱性化合物，文献报道的芬太尼的pKa是8.4［10］。实验中最终选择了pH=11～12的碱性条件和乙醚提取溶剂。

2.2 HPLC-DAD法定性分析芬太尼通过全光谱扫描最终确定了205 nm作为测定波长。流动相的选择上，实验中发现乙腈相较于甲醇色谱基线平稳、仪器柱压更低，因此选择基于乙腈的流动相，并同时优化了乙腈和水的比例，确定流动相乙腈∶水=40∶60的流动相组成。该条件下芬太尼的出峰时间为3.356 min。HPLC-DAD法的样品和标准品的色谱峰见图1。

图1 Fentanyl的高效液相色谱图

2.3 LLE-GC-MS方法验证

2.3.1 稳定性结果显示考察时间内芬太尼的出峰时间变化小，峰面积波动较小，由出峰时间和峰面积计算相对偏差分别＜3%，稳定性结果见图2。7天4℃冷藏条件下芬太尼峰形稳定，无分解峰，浓度不改变，标准溶液稳定性好。

图2 峰面积和保留时间稳定性结果

2.3.2 特异性在优化的LLE-GC-MS的实验条件下，我们考察了本方法对芬太尼以及毒（品）物分析中经常涉及的甲基苯丙胺、氯胺酮、哌替啶的响应情况。结果显示芬太尼的保留时间为14.017 min，见图3，其主要特征离子峰分别为245、146、202。在相同的分析条件下，甲基苯丙胺的出峰时间是4.325 min，氯胺酮的出峰时间是8.437 min，哌替啶的出峰时间是13.125 min。在相同的分析条件下，我们用该方法对空白血液、待测血液以及待测胃内容物进行了分析测试，其总离子流图见图4。空白血液在芬太尼出峰位置附近没有干扰峰（红线），待测血液（绿线）和胃内容物（蓝线）在14 min附近有芬太尼的色谱峰出现，且和内源性物质的峰达到基线分离，满足定性定量分析要求。

图3 10μg·mL-1芬太尼标准溶液总离子流出图

图4 空白和待测样品总离子流出图

2.3.3 检出限、定量限和线性LLE-GC-MS法分析对血液中芬太尼的浓度在1～500 ng·mL-1范围内呈现良好的线性关系，线性方程为：Â=24.84C＋887.78，相关系数r为0.999 4，检出限为0.02 ng·mL-1，定量限为1.0 ng·mL-1。

2.3.4 准确度、精密度和回收率芬太尼测定的准确度为90.33%～109.98%，日内精密度和日间精密度均为2.53%～3.00%。标准添加样品的回收率为69.6%～72.8%。

2.3.5 LLE-GC-MS分析方法的法医学应用某50岁男性自行服用从外地购买的戒毒药物后出现嗜睡、呕吐等不适，继而死亡。用本文建立起来的液液萃取-气相色谱-质谱联用法（LLE-GC-MS）检测了死者的血液和胃内容物，测定结果见表1。血液中检出了芬太尼，含量为（25.76±0.65）ng·mL-1；胃内容物中检出了芬太尼，含量为（0.51±0.03）μg·g-1。

表1 待测样品定量参数和测定结果

3 讨论

生物样本中芬太尼的定性和定量分析在司法实践中有重要意义，色谱法具有准确度好、灵敏度高的优点。合理的样品前处理方法是色谱分析的关键，本实验首先优化了样品前处理的pH和提取溶剂。实验中考虑到芬太尼的酸度系数(pKa)是弱碱性，碱性条件使芬太尼结构中的氮元素最大可能地转化为三级胺进入有机相，抑制解离最适宜的pH为高于该毒物pKa的1～2。因此本实验选择了pH=11～12的碱性条件作为生物样本中芬太尼提取的pH条件，该条件也是血液中常见药（毒）物分析中广泛使用的条件。因而，该方法中的提取条件在生物样品药（毒）物分析中具有较普遍的适用性。另一方面，生物样本（血液、尿液）中芬太尼的提取溶剂文献已报道的有正己烷-乙醇、正己烷-二氯甲烷-异丙醇、乙酸乙酯：氨水等。由于乙醚的沸点低、溶剂去除时可以通过简单的水浴方法，实验设备简单、操作方便。因此，本实验选择乙醚作为生物样本中芬太尼的提取溶剂。生物样本中芬太尼的定性分析是通过优化高效液相色谱-二极管阵列检测器法（HPLC-DAD）检测波长、洗脱溶剂和梯度，建立起可用于芬太尼浓度含量高的样本分析方法，实验中观察到最佳流动相条件下，柱压较低、基线平稳。同时，样品中芬太尼和标准品的出峰时间基本一致，峰型对称性较好，可以满足定性分析要求。尽管本实验建立的HPLC-DAD测定芬太尼具有分析时间短（3.356 min）的优点，但是不适于芬太尼含量较低（＜0.05μg·mL-1）的生物样本。在此实验基础上，为了克服HPLC-DAD法的实际应用的不足，通过优化仪器和实验条件建立了液液萃取-气相色谱-质谱联用法（LLE-GC-MS）的芬太尼定量分析方法，并用于血液和胃内容物中芬太尼的快速测定。总之，本实验优化并建立了高效液相色谱-二极管阵列检测器法（HPLC-DAD）定性分析芬太尼和液液萃取-气相色谱-质谱联用法（LLE-GC-MS）定量分析芬太尼的方法。HPLC-DAD法样品具有分析时间短的优点，但无法满足恒量浓度芬太尼样品的分析测定。因此，本实验进而建立了芬太尼快速测定的LLE-GC-MS法。LLE-GC-MS法样品前处理简单，灵敏度好，准确率高，实用性强，适用面广，适用于法医学检验和司法鉴定活动中涉及的芬太尼的检测，同时LLE-GC-MS法也适用于临床上芬太尼药物浓度的监测。