动物生物安全三级实验室内新型冠状病毒实验活动的防护措施探讨

冯小丽，李明华，韩建保，瞿 望，都洪弟，邓忠华，郑永唐，2

（1.中国科学院昆明动物研究所，国家昆明高等级生物安全灵长类动物实验中心，中国科学院生物安全大科学研究中心；2.中国科学院昆明动物研究所，中国科学院动物模型与人类疾病机理重点实验室，云南 昆明 650223）

2019年12月，湖北省武汉市暴发了不明原因引起的肺炎，后续研究证实该肺炎由一种新型冠状病毒引起，2020年2月11日，世界卫生组织（Word Health Organization，WHO）将这一新发传染病正式命名为新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19），同时，国际病毒分类委员会将这一新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2）。根据WHO发布的数据，全球有211个国家和地区报告了COVID-19疫情，遍布世界5大洲。截至2021年6月17日24时，中国大陆累计报告确诊病例91 534例，累计死亡病例4 636例。中国大陆以外国家和地区累计报告确诊病例178 347 369例，累计死亡病例3 854 881例（https：//www.who.int）。COVID-19疫情对人类健康和世界公共卫生安全构成了重大威胁［1］。

2020年1月20日国家卫生健康委员会将新型冠状病毒肺炎纳入法定传染病乙类管理［2］，并采取甲类传染病的预防和控制措施。2020年1月23日国家卫生健康委员会要求SARS-CoV-2病原体暂按照病原微生物危害程度分类中第二类病原微生物进行管理［3］。因此所有涉及SARS-CoV-2活病毒的分离、培养、动物感染等实验活动均要求在生物安全三级（BSL-3/ABSL-3）实验室内进行，由于SARS-CoV-2传染性强，人群普遍易感［4］，因此加强BSL-3/ABSL-3实验室的生物安全防护尤为重要。

笔者所在的中国科学院昆明动物研究所国家昆明高等级生物安全实验中心于2020年2月获得新型冠状病毒CNAS（China National Accreditation Service for Conformity Assessment）认可证书及国家卫生健康委员会活动资质批复。开展了SARS-CoV-2的分离培养、SARS-CoV-2感染灵长类动物模型建立［5］、SARS-CoV-2感染小鼠动物模型建立［6］、SARS-CoV-2感染树鼩动物模型建立［7］、抗SARS-CoV-2的药物活性评价［8］等工作。

本文结合笔者在BSL-3/ABSL-3实验室开展SARS-CoV-2实验活动的实践经验，就生物安全防护，包括个人防护、实验操作、实验后清场消毒等各个环节的风险及生物安全防护措施进行了概述，以供相关实验室参考。

1 COVID-19流行病学特点及实验室暴露风险因素

1.1 传染源传染源主要是新型冠状病毒感染的患者和无症状感染者，在潜伏期即有传染性，发病后5天内传染性较强［9］。

1.2 传播途径主要传播途径是经呼吸道飞沫传播和密切接触传播。接触病毒污染的物品也可能造成感染，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能。在粪便、尿液中也能分离到新型冠状病毒，所以有对环境污染造成SARS-CoV-2接触传播或气溶胶传播的可能。

1.3 SARS-CoV-2的传染性和致病性SARS-CoV-2属于高致病性病原体，具有较强的传染性。人际传播指数（R0，basic reproduction number）作为衡量某一病原体传染性强弱的重要指标，数值越大传染性就越强。据报道，SARS-CoV-2的R0值在1.4～6.49之间，即每一个受染者可将病毒传染给2～7个正常人［10-12］。人群对SARS-CoV-2普遍易感，感染后或接种新型冠状病毒疫苗后可获得一定免疫力，但持续时间尚不明确。潜伏期一般为1～14 d，多为3～7 d，感染SARS-CoV-2后的临床症状主要表现为发热、干咳和乏力等，少数患者可伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状，重症患者多在发病1周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速进展为严重急性呼吸综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍及多器官功能衰竭等［13-15］。多数患者预后良好，少数患者病情危重，特别是老年人和有慢性基础疾病者预后较差。根据WHO每日情况报告显示，全世界的COVID-19死亡率约为6.4%，虽然SARS-CoV-2的致死率远低于SARS-CoV（10%～12%）和MERS（30%～34%）［16］，但是SARS-CoV-2的传染性更高，因而更具致命性。

1.4 病毒抵抗力及灭活条件SARS-CoV-2在空气中可存活3 h左右，在塑料和不锈钢等物体表面存活长达2～3 d［17］。SARS-CoV-2对热和紫外线较敏感，56℃30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒，氯己定不能有效灭活病毒［18］。

1.5 实验室暴露风险因素在BSL-3/ABSL-3实验室开展SARS-CoV-2病毒相关实验活动，实验人员经常会接触到SARS-CoV-2活病毒，SARS-CoV-2感染动物的血液、组织、尿液、粪便等样本，另外样本在离心、匀浆等过程中也可能产生含有SARS-CoV-2的气溶胶，极易导致实验人员感染SARS-CoV-2。此外，实验人员如果生物安全意识不强，未严格按照标准操作规程进行实验，也极易发生职业暴露。加之有些实验室生物安全管理经验不足，缺乏预防SARS-CoV-2感染的安全管理措施和应急预案，一旦发生生物安全事故，不能及时采取有效的应对措施，将增加实验人员感染SARS-CoV-2的风险。

2 开展SARS-CoV-2相关实验的风险识别

2.1 SARS-CoV-2感染性样本的包装、运输风险识别（1）包装材料选择不当，导致病毒泄漏；（2）内层容器密封不严，导致病毒泄漏；（3）填充材料不能很好的保护内容物；（4）运输过程中因颠簸导致包装物破损、样品泄漏；（5）运输过程中可能发生车祸、被盗、抢劫等意外，导致病毒泄露、扩散。

2.2 操作SARS-CoV-2感染性样本相关风险识别

2.2.1 SARS-CoV-2感染性样本接收风险识别（1）毒种或样本泄漏，造成实验人员暴露；（2）低温保护填充物失效，造成毒种或样本泄漏失活。

2.2.2 SARS-CoV-2病毒或感染性样本的分离与培养及保存风险识别（1）样品离心过程中离心管破裂导致病毒泄漏；（2）打开样品管盖、移液、稀释、混匀等操作过程中产生气溶胶；（3）离心感染性样品后消毒不彻底。

2.2.3 病毒核酸提取风险识别（1）提取核酸试剂盒中的Binding Buffer或Trizol等具有消毒作用的试剂，因作用浓度和作用时间不够，导致病毒裂解不彻底；（2）将感染性材料灭活后转移出BSL-3/ABSL-3实验室时，因表面消毒不彻底导致环境污染或工作人员暴露。

2.2.4 SARS-CoV-2感染实验动物饲养及实验过程风险识别（1）感染SARS-CoV-2的实验动物逃逸；（2）抓取实验动物时被SARS-CoV-2感染性实验动物抓伤或咬伤；（3）麻醉、采血、解剖等实验过程中，实验人员因使用注射器、采血针、解剖器械等利器被刺伤或割伤导致感染；（4）动物剖检过程中产生SARS-CoV-2感染性废液、气溶胶导致环境污染；（5）实验人员疲劳操作，操作失误几率增大，增大SARS-CoV-2感染风险；（6）将多聚甲醛固定但灭活不彻底的SARS-CoV-2感染性组织样本带出BSL-3/ABSL-3实验室导致环境污染或实验人员暴露；（7）动物实验过程中产生的废弃物因包装不密封或垃圾袋转运至双扉灭菌器过程中因外表面消毒不彻底导致SARS-CoV-2污染环境；（8）灭菌不彻底的动物尸体或其他废弃物运出实验室，导致SARS-CoV-2污染环境或工作人员暴露。

2.3 使用实验仪器设备的风险识别（1）离心机：离心SARS-CoV-2感染性样品过程中离心管破裂导致SARS-CoV-2感染性样品泄漏污染环境和人员暴露；（2）超低温冰箱或液氮罐：保存SARS-CoV-2毒种的冻存管破裂或炸裂导致SARS-CoV-2泄露，造成环境污染或实验人员暴露；（3）Ⅱ级A2型生物安全柜：生物安全柜HEPA过滤膜失效导致含有SARS-CoV-2的气溶胶泄漏污染环境或人员暴露；停电导致生物安全柜停止运行；生物安全柜负压出现异常；生物安全柜使用后没有消毒或消毒不彻底；生物安全柜内SARS-CoV-2感染性样品溢洒；（4）负压动物饲养隔离器：隔离器故障、停电停机等导致负压异常，SARS-CoV-2气溶胶泄漏到实验室外污染环境；笼具消毒灭菌不彻底传出实验室导致SARS-CoV-2泄漏污染环境等。

2.4 实验后清场及废弃物处理风险识别（1）消毒剂失效导致消毒不彻底；（2）实验人员未严格按标准作业程序（Standard Operating Procedure，SOP）进行操作，清场不彻底，导致SARS-CoV-2泄露；（3）废弃物未正确分类并选择相应的灭菌程序进行灭菌，灭菌不彻底，导致SARS-CoV-2泄露；（4）双扉灭菌器异常，导致SARS-CoV-2泄露。

3 针对上述风险采取的生物安全防护措施

3.1 SARS-CoV-2实验期间人员防护措施

3.1.1 BSL-3实验室人员防护要求穿一次性内衣/内裤，洗手衣，一次性帽子，袜子，N95口罩，一次性连体服，正压头罩，反穿衣，双层手套（内层为一次性深色丁腈手套，外层为一次性乳胶手套），防水中筒胶靴，一次性靴套。

3.1.2 ABSL-3实验室人员防护要求穿一次性内衣/内裤，洗手衣，一次性帽子，袜子，N95口罩，一次性连体服，正压头罩，反穿衣，双层手套（内层为一次性深色丁腈手套，外层为一次性乳胶手套），防水中筒胶靴，一次性靴套。必要时穿戴防抓咬或防割伤手套。

3.1.3 个人防护用品的穿脱流程见图1和图2。

图1 个人防护用品的穿戴流程

图2 个人防护用品的脱卸流程

3.2 SARS-CoV-2感染性样本的包装、运输防护措施

3.2.1 SARS-CoV-2感染性样本的包装按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》《国际航运协会危险品运输管理规定》等相关法规，采取A类包装，符合UN2814要求，应按照三重包装系统进行包装。

3.2.2 一律选用带有螺旋盖的冻存管、试管等保存SARS-CoV-2感染性样本。

3.2.3 填充材料必须完全包裹内层包装；保证在任何姿态下内层包装均不会变形、破裂；保证在内容物溢出的情况下可以完全吸附溢出液体；如同时包装2个以上的内容物，必须用填充物相互隔开。

3.2.4 随样品配备泄漏处理包应包含足够量的个人防护装置和消毒剂，如发生泄漏，应立即对泄漏物进行处理，并清除泄漏区域的污染，处理过程中产生的垃圾必须先收集起来，经高压灭菌后再处理。

3.2.5 应通过陆路专用车辆运输SARS-CoV-2感染性样本；应事先与接收单位确定运送的时间和运输方式，提前办理运输手续，并报送公安机关和属地卫生健康委员会，如发生突发情况，相关责任人应按程序及时上报。

3.3 操作SARS-CoV-2感染性样本的防护措施

3.3.1 所有直接接触SARS-CoV-2（包括感染性样本的打开、病毒分离、培养、滴定、中和实验、病毒感染性样本的核酸提取等）的操作均在Ⅱ级A2型生物安全柜中进行。实验开始前在生物安全柜台面操作区铺一层浸有消毒剂的吸水纸巾，一旦有感染性液体溢洒，立即用浸有消毒剂的吸水纸巾进行擦拭消毒，并更换新的消毒纸巾。

3.3.2 核酸提取时，严格按照试剂说明书进行，也可适当增加试剂用量或延长作用时间，保证病毒充分灭活。

3.3.3 BSL-3实验室内均使用质量合格的螺口管，涉及SARS-CoV-2感染性样品离心时，均使用生物安全密封型离心机转子或离心管套筒。所有SARS-CoV-2感染性样品的装卸均在生物安全柜中进行，所有物品拿出生物安全柜前均用75%酒精进行表面喷洒消毒。

3.3.4 从超低温冰箱或液氮罐中取SARS-CoV-2毒种或其他SARS-CoV-2感染性样品时，必须戴防冻手套，毒种或样品取出后立即放于可密闭的容器内再转移至生物安全柜中，表面用75%酒精消毒后再打开样品管。

3.3.5 生物安全柜使用完后，台面用浸有75%酒精的吸水纸进行擦拭消毒，废弃物分类包装并表面消毒后再拿出生物安全柜，然后开启紫外杀菌灯，消毒时长至少30 min。

3.3.6 所有SARS-CoV-2感染的实验动物饲养均在负压动物隔离器中进行，每天由经过培训合格的实验人员对实验动物进行饲养、观察、废弃物清理。

3.3.7 开展动物实验前，先对SARS-CoV-2感染的动物进行可靠麻醉，必要时戴防抓咬手套或借助工具。如抓取小鼠时，先用镊子夹住小鼠尾部，再放入诱导麻醉盒中进行麻醉；对实验猴进行麻醉前，先借助负压隔离器上的保定装置对实验猴进行保定后，再麻醉。

3.3.8 进行动物实验时，涉及注射器的使用，禁止将取下的针头保护套再套回，使用过的针头置于专用的利器盒中。进行动物解剖实验时，应使用钝头手术剪，避免使用尖头手术剪和刀片；实验人员不要交叉左右手进行操作；手术器械的摆放应按一定方向，并根据实验人员的操作习惯摆放。

3.3.9 提前安排好实验时间，不得连续在ABSL-3实验室内工作超过4 h，避免疲劳操作。

3.3.1 0采取多聚甲醛固定的SARS-CoV-2感染性样品时，单个样品体积不能过大，并保证样品完全浸泡在多聚甲醛中。室温下，感染性样品浸泡在多聚甲醛中至少7 d后才可转出实验室开展后续实验，以保证SARS-CoV-2被完全灭活。

3.3.1 1每个实验项目结束后，先用75%酒精对负压动物隔离器内外进行喷洒消毒，再用紫外消毒装置对环境进行消毒，最后对负压动物隔离器和实验室环境进行清场清洁，最后再次使用75%酒精对负压动物隔离器内外和环境进行喷洒消毒，为开展下一个实验项目做准备。

3.4 关键仪器设备使用的防护措施

3.4.1 对所有实验人员进行仪器设备的操作培训，培训合格后方能使用该仪器；每种仪器设备旁均应放置操作SOP，实验人员必须严格按照SOP进行操作，一旦仪器出现故障需联系专人进行处理。

3.4.2 所有设备由设备管理员进行定期清洁、维护和保养。

3.4.3 建立应急事故处理流程并对相关人员进行培训，如离心机运行过程中怀疑发生离心管破碎，应第一时间关闭离心机电源，静置30 min后再将离心机转头转移至生物安全柜进行处理。

3.4.4 BSL-3/ABSL-3实验室的所有关键仪器设备均与不间断电源（Uninterruptible power system，UPS）相连，避免停电造成意外事故的发生。

1.1 对象 2010年9月—2011年12月抽取社区脊髓损伤神经源性膀胱功能障碍者76例，其中男39例，女37例，年龄19～74岁，平均年龄(45.7±3.3)岁;脊髓损伤部位:颈椎14例，胸椎39例，腰椎23例;损伤程度:完全性损伤18例，不完全性损伤58例;文化程度:小学以下1例，初高中61例，大学以上14例;经济收入:1 000元以下38例，1 000～2 000元31例，2 000元以上 7例;病程 1～39年，平均(10.5±2.5)年。

3.5 实验后清场消毒及废弃物处理的防护措施

3.5.1 实验室常用的消毒剂为75%酒精和0.55%次氯酸钠溶液，消毒剂由专人进行配置，现用现配，24 h内使用。

3.5.2 每次实验结束后，用75%酒精浸泡的吸水纸巾擦拭工作台面（包括生物安全柜、实验台等）及使用过的设备表面。

3.5.3 对实验过程中产生的可能带有感染性的废弃物及污染材料进行分类包装，实验产生的废弃物分为固体废弃物、液体废弃物、利器、动物尸体等，利器放入专用利器盒中，再用生物安全垃圾袋进行包装，其余废弃物全用生物安全垃圾袋进行包装。

3.5.5 为保证废弃物可靠灭菌，每月定期对双扉灭菌器进行灭菌性能验证，保证所有感染性物质可靠灭菌后才传出实验室。

3.5.6 对需要传出实验室但不能高压灭菌的实验样品（如提取的RNA）或实验仪器等，采取75%酒精表面喷洒消毒后，经传递窗紫外消毒30 min（不能经紫外照射的实验样品，可用不透光的容器进行包装）的方式传出实验室。

3.5.7 BSL-3/ABSL-3实验室定期（每月1次）进行预防性消毒，实验室台面、仪器表面用喷有75%酒精的吸水纸进行表面擦拭消毒；实验室地面用浸有75%酒精的一次性拖布进行擦拭消毒，使用过的吸水纸、一次性拖布按感染性废弃物处理。

4 小结

新型冠状病毒传染性高，易造成职业暴露感染，给BSL-3/ABSL-3实验室的生物安全带来了巨大的挑战，采取切实有效的生物安全防护措施可防止实验人员感染或环境污染。本实验室自开展SARS-CoV-2实验以来，严格按照生物安全防护要求同时结合SARS-CoV-2的微生物学特性，采取有针对性的防护措施，同时实验人员严格按照管理要求执行，至今未发生实验人员感染或环境污染事件，可为其他开展SARS-CoV-2实验的实验室生物安全防护工作提供参考。