生物膜层DO浓度对MABR中异养硝化-好氧反硝化的影响

康宝文, 肖芃颖, 周 靖, 袁 港, 郭 雷

重庆理工大学化学化工学院, 重庆 400054

化工、畜禽养殖废水和垃圾渗滤液等高浓度氨氮(NH4+-N)废水具有排放量大、生物毒性强和处理难度高的特质[1]，已成为含氮废水处理领域的研究重点. 高氨氮废水处理方法主要有物化法和生物法，其中生物法因其更经济和环保的优势得以广泛应用[2]. 依据部分硝化反应(NH4++1.5O2→NO2-+H2O+2H+)和完全硝化反应(NH4++2O2→NO3-+H2O+2H+)的理论计算可知：1 mol NH4+需要1.5 mol O2氧化生成NO2-，2 mol O2氧化生成NO3-，1 g NH4+-N理论上需要约4.6 g O2才能完全氧化[3]. 因而，无论是发生部分硝化还是完全硝化反应，处理高氨氮废水都将会消耗较多O2. 传统好氧生物脱氮技术普遍采用鼓风曝气方式供氧，存在氧传质效率低、能耗高的缺陷[4]，具备高效供氧和低能耗优势的膜曝气生物膜反应器(membrane-aerated biofilm reactor, MABR)得以发展. 采用MABR进行生物脱氮已成为处理高氨氮废水的一项新颖潜力技术[5].

目前，关于MABR生物脱氮的相关研究主要聚焦于反应器运行机制、工艺优化及技术应用等方面[6-8]. 学者们对MABR生物脱氮理论的深入研究发现，生物膜层溶解氧(DO)浓度是影响MABR脱氮性能的重要因素之一[9-10]. 有研究[11]表明，在MABR生物膜层中，生长较快的异养型微生物极易与生长缓慢的自养型微生物同时沉积在生物膜层的某微观区域竞争O2，使具有好氧硝化功能的自养型氨氧化菌(aerobic oxide bacteria, AOB)，与具有厌氧反硝化功能的常规异养菌(heterotrophic bacteria, HB)和(或)自养型厌氧氨氧化菌(anammox bacteria)之间无明确的分界线，这导致在脱氮过程中好氧硝化与厌氧反硝化难以协调平衡. 调节MABR生物膜层DO浓度可促使一种特殊活性分层产生，利于MABR的硝化与反硝化过程[12]. 然而，传统硝化细菌(AOB和NOB)对高浓度NH4+-N耐受性差[13]，限制了MABR在高氨氮废水处理中的应用[14-15].

异养硝化-好氧反硝化(heterotrophic nitrification-aerobic denitrification, HN-AD)微生物，作为一类能耐受高浓度NH4+-N和有机碳的新型脱氮菌，可高效去除各形态的氮污染物，无有害中间产物亚硝态氮(NO2--N)和硝态氮(NO3--N)的积累，单菌种实现同步硝化反硝化脱氮[16]. 由HN-AD菌主导的异养硝化好氧反硝化过程，已被证实广泛存在于生物流化床、生物转盘和SBR等多种废水生物处理反应器中[17-19]，具有HN-AD功能的生物脱氮技术成为高氨氮废水处理的技术新秀. HN-AD菌属在不同DO浓度下的脱氮性能存在较大差异[20]，例如：假单胞菌属PseudomonasstutzeriKTB在DO浓度从1.28 mg/L升至1.57 mg/L的过程中，NO3--N去除率从45.1%升至99.2%[21]；不动杆菌属AcinetobacterhaemolyticusZYL在DO浓度大于4.8 mg/L时具有最佳的反硝化效果[22]；枯草芽孢杆菌属BacillussubtilisA1在DO浓度为3.1～7.9 mg/L范围内达到高效好氧硝化和反硝化性能[23]. 在MABR中，O2透过中空纤维膜扩散至生物膜层，改变膜腔内的氧通量进而引起生物膜层中DO浓度的变化[24]. 生物膜层DO浓度不仅与HN-AD 菌生长代谢过程中细胞增殖分化程度有关，还影响其脱氮功能基因的表达[25]. 因此，探究生物膜层DO浓度对MABR中HN-AD菌多样性及其脱氮功能的影响，将有助于明晰MABR的HN-AD特性.

该研究将笔者所在课题组前期筛选的脱氮混合菌接种于贯通式的MABR中，并进行菌液挂膜，调节进气量实现MABR生物膜层的不同DO浓度水平，考察生物膜层DO浓度对MABR脱氮性能和HN-AD菌多样性的影响，并预测MABR中关键脱氮功能基因丰度的变化规律，揭示MABR中HN-AD过程的微生物作用机制，以期为MABR处理高氨氮废水的应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 MABR装置及运行条件

贯通式MABR装置示意如图1所示. 由图1可见，MABR由有机玻璃装置和膜组件构成，顶部加盖密封，留取样小孔. MABR有效体积为1.2 L，膜组件材料为聚偏氟乙烯(PVDF)，膜丝内、外径分别为1.7和2.0 mm，膜孔径为0.1 μm，有效比表面积为1.25 cm2/cm3. MABR水力停留时间(HRT)为48 h，水循环流速为40 mL/min，膜组件经充氧试验测得泡点压力为12.5 kPa. MABR启动和运行过程中保持曝气压力低于泡点压力可达到高效的供氧效率[26]. 因此，MABR启动阶段的曝气压力设定为10 kPa. 调节进气量可改变膜-水界面跨膜传质过程中的氧通量，引起生物膜层的DO浓度变化. 故在反应器稳定运行后，分别调节进气量为0.1、0.6和1.0 L/min(试验中测得对应曝气压力分别为3、8和12 kPa，均低于泡点压力)，进而实现MABR生物膜层的不同DO浓度.

注： 1—合成废水；2—进水水泵；3—取样及微电极测试小孔；4—出水；5—气泵；6—气体流量计；7—压力表；8—水循环泵；9—膜组件；10—排气阀.

1.2 接种菌液与试验用水

已有研究[27]表明，贯通式MABR可通过菌液挂膜富集HN-AD菌以实现高效同步硝化反硝化. 因此，接种60 mL HN-AD脱氮混合菌液于反应器进行菌液挂膜(混合菌筛选自猪场沼液、垃圾渗滤液、化工废水等高氨氮废水中，COD、NH4+-N、TN去除率均在90%以上). 试验进水为高氨氮模拟废水，以(NH4)2SO4和CH3COONa为唯一氮源和碳源，进水NH4+-N浓度为465～534 mg/L〔(NH4)2SO42.0～2.3 g/L〕，进水COD浓度为 4 700～5 290 mg/L(CH3COONa 5.8～6.6 g/L)，其他微量元素(50 mL/L)包括MgSO4·7H2O 2.0 g/L、MnSO4·H2O 0.1 g/L、CaCl21.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.1 g/L、K2HPO45.0 g/L. 反应器进料pH保持在7.5～8.0之间，反应器料液温度通过水浴加热控制在(25±2)℃.

1.3 水质组分和生物膜表观特征分析

NH4+-N、TN、COD以及氮转化中间产物NO2--N、NO3--N的浓度均参照《水和废水监测分析方法》(第四版)[28]进行测定. 菌液浓度(OD600 nm)采用紫外分光光度计(752型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)测定，pH采用pH仪(MettlerToledo FE20)测定.

采用扫描电镜(SEM, TESCAN MIRA3)技术表征反应器挂膜阶段的生物膜表观形态特征. 将采集的生物膜样品用2.5%戊二醛固定2～4 h后，经磷酸缓冲液(pH=7.0)清洗3次，再分别用30%、50%、70%、85%和95%浓度的乙醇洗脱1次，100%乙醇洗脱2次(每次脱水时间均为15～20 min)，将脱水后的样品装入滤纸盒，放入冷冻干燥仪中冷冻干燥12 h，将制备完成的样品送至武汉铄思百检测技术有限公司进行SEM分析.

1.4 生物膜层DO浓度测定分析方法

生物膜层DO浓度可通过溶氧微电极进行原位测定[29]. 该研究采用Unisense©微电极分析系统对不同进气量条件下生物膜层DO浓度进行实时测定. Unisense©微电极分析系统由Clark型溶氧微电极(Unisense OX25，Denmark)和主机(UnisenseA/S，Denmark)两部分组成. 测试前，对溶氧微电极进行零点及饱和DO值校准[30]. 测试期间，微电极垂直于生物膜表面，每隔50 μm测得一个DO浓度，每个深度的DO浓度平行测定3次，最终将测得的DO浓度绘制成生物膜层DO剖面曲线.

1.5 DNA提取、高通量测序及脱氮功能基因预测

采用无菌剃刀刮取不同进气量条件下膜丝表面的生物膜样品(每个样品约0.5 g)，短期保存于-80 ℃冰箱中. 通过MobioPowerSoil®DNA Isolation Kit试剂盒提取样品的基因组DNA，经预处理后送至高通量测序平台PE300(上海美吉生物医药科技有限公司)进行测序分析. 对16S rRNA基因V3/V4区进行扩增，通用引物序列为338F(5′-ACTCCTACGGGAGG CAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3′)[31]. 采用Trimmomatic和Flash软件对测序序列进行拼接，通过Usearch软件对具有97%相似性的序列进行OTU聚类，经Usearch_global获得OTU序列丰度统计表用于后续微生物群落多样性分析；采用基于KEGG数据库的PICRUSt1软件对样品中微生物脱氮功能基因进行预测分析[32].

2 结果与讨论

2.1 MABR启动运行性能

MABR在16 d内实现菌液挂膜和驯化，反应器启动运行性能见图2. 由图2(a)可知，反应器启动的第0～6天内，液相中OD600 nm先增后降；第7～16天，OD600 nm保持在0.4左右. SEM表征结果(见图3)显示，反应器启动6 d后，膜丝表面开始附着少量杆菌和球菌，继续运行至16 d，膜丝表面已明显可见大量杆菌. OD600 nm变化与SEM表征结果说明接种菌液的微生物已附着膜丝表面形成生物膜. 由图2(b)可知，MABR启动的第6天，NH4+-N、COD和TN进水浓度分别为465.23、5 190.84 和465.23 mg/L，出水浓度分别为176.68、1 604.82 和193.20 mg/L，去除率分别为62.02%、69.08%和58.47%，说明接种菌液中微生物活性得到激活. 反应器运行至第16天，NH4+-N、COD和 TN的进水浓度分别为492.36、5 109.31 和492.36 mg/L，出水浓度分别为161.35、1 298.18 和177.45 mg/L，去除率相比第6天分别增至67.23%、74.59%和63.96%，说明在适应期内膜丝表面生长富集的微生物具有稳定的脱氮功能. 此外，反应器启动运行过程中，出水NO2--N和NO3--N浓度低，分别为0.52和3.06 mg/L〔见图2(a)〕，说明反应器在菌液挂膜驯化过程中无明显中间产物积累，MABR成功启动并具备同步硝化反硝化性能.

图2 MABR启动运行性能

图3 MABR启动运行阶段生物膜的表观结构特征

2.2 生物膜层DO浓度分布及其对MABR脱氮性能的影响

MABR中生物膜层DO浓度分布如图4所示. 当进气量从0.1增至1.0 L/min时，生物膜内层DO浓度由0.94 mg/L逐步提高至3.67 mg/L，但DO始终未能穿透整个生物膜层，致使生物膜外层DO浓度始终为0 mg/L. 上述结果说明，在MABR中改变进气量主要引起生物膜内层DO浓度的升高. 当进气量为0.1、0.6和1.0 L/min时，DO穿透生物膜层(DO浓度≥0.1 mg/L)的深度分别为200、240和400 μm，生物膜层厚度随进气量增大而增加；进气量为0.1 L/min 时，生物膜内未能形成好氧层区域(DO浓度≥2.0 mg/L)，生物膜从内至外仅缺氧—厌氧两个分层，当进气量提升至0.6和1.0 L/min时，生物膜内形成好氧层且其厚度分别为30和100 μm，此时生物膜从内至外形成好氧—缺氧—厌氧3个分层. 上述结果说明，提高进气量促进了生物膜内好氧层厚度增加，且丰富了MABR生物膜分层结构.

注： 靠近膜-生物膜界面表示生物膜内层，靠近生物膜-液相界面表示生物膜外层.

不同进气量条件下，MABR中NH4+-N、COD和TN去除效果如图5所示. 当生物膜内层分别为低DO浓度(进气量为0.1 L/min)、中DO浓度(进气量为0.6 L/min)和高DO浓度(进气量为1.0 L/min)时，平均进水NH4+-N和TN浓度均为487.70 mg/L，出水NH4+-N和TN浓度分别为274.91、195.47、135.35 mg/L和284.15、222.05、163.69 mg/L，NH4+-N和TN去除率分别为43.64%、60.06%、71.79%和41.72%、54.62%、65.90%，高DO浓度下反应器NH4+-N和TN去除率相比低DO浓度分别增加28.15%和24.18%. 调节进气量过程中，反应器出水NO2--N和NO3--N浓度始终保持较低水平(出水NO2--N和NO3--N浓度分别为1.86和1.29 mg/L)，未见明显NO2-和NO3-积累；同时，反应器的COD去除率在上述3种DO浓度下均稳定在72%～88%范围内. 上述结果说明，提高生物膜内层DO浓度仅对MABR的脱氮性能具有正向影响. 提高进气量增加生物膜内层DO浓度拓宽了生物膜内好氧层区域，有利于增强好氧微生物降解潜力[33]，对强化MABR脱氮性能起着重要作用.

图5 不同进气量下MABR的去污性能

2.3 生物膜层DO浓度对MABR中脱氮微生物特性的影响

2.3.1微生物α多样性指数分析

α多样性指数分析是指通过统计学计算方法对局域均匀生境下的群落进行物种均匀度、丰富度两个层面的多样性特性分析. Shannon-Wiener指数和Simpson指数常用于表示微生物的多样性特征，Shannon-Wiener指数越低表明群落多样性越单一，而对应的Simpson指数越大,说明群落中优势菌属生态功能相对更显著；Ace指数和Chao指数是衡量样品中微生物物种丰富度的标准，Ace指数和Chao指数越高，群落丰富度越高[34]. 生物膜内层不同DO浓度下采集的生物膜样品(F0.1、F0.6、F1.0)微生物α多样性结果如表1所示. 通过MiSeq Illumina测序分析获得267～338个OTUs，Coverage(覆盖度)>99%表明测序深度包含了测序样品的全部细菌. 由Shannon-Wiener指数和Simpson指数结果可知，F0.1样品中微生物物种多样性最丰富，F1.0样品中微生物物种相对单一，说明提高生物膜内层DO浓度虽然降低了MABR中微生物多样性，但可能促进优势菌属的生态功能作用；同时，与F0.1、F0.6样品相比，F1.0样品中Chao指数和Ace指数最小，说明高进气量条件采集的样品(F1.0)中微生物群落丰富度最低. 这主要是因为高进气量使生物膜内层形成高DO浓度环境，更有利于好氧微生物的选择性竞争，进而降低了MABR中微生物群落丰富度.

表1 MABR中微生物α多样性指数

2.3.2MABR中脱氮微生物群落结构分析

选取样品中相对丰度大于3%的脱氮菌属进行菌群结构分析，结果如图6所示. 随着生物膜内层DO浓度增加，传统硝化和反硝化脱氮菌属，包括水微菌属(Aquamicrobium)、红杆菌属(unclassified_f_Rhodobacteraceae)、特吕珀菌属(Truepera)、生丝单胞菌属(Hyphomonas)和弓形杆菌属(Arcobacter)，总相对丰度由30.03%降至10.49%；而适宜好氧条件生长的HN-AD菌属，包括假黄褐藻属(Pseudofulvimonas)、脱氮副球菌属(Paracoccus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)和不动杆菌属(Acinetobacter)[35]，总相对丰度由10.40%升至11.86%. 上述结果说明，提高生物膜内层DO浓度降低了MABR中传统脱氮菌属丰度，但促进了HN-AD菌属丰度的增加，进而对MABR中脱氮微生物群落结构存在一定影响.

图6 MABR中微生物群落组成

为进一步了解生物膜层不同DO浓度下HN-AD菌群落组成变化，筛选样品中相对丰度大于1%的HN-AD菌属进行多样性分析，结果如图7所示. 除Pseudofulvimonas、Paracoccus、Sphingobacterium和Acinetobacter外，反应器也成功富集了产碱杆菌属(Alcaligenes)、气单胞菌属(Aeromonas)、从毛单胞菌属(Comamonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、细杆菌属(Microbacterium)和红球菌属(Rhodococcus)等HN-AD 菌属[36]，共计13种，其总相对丰度在生物膜内层低、中和高3种DO浓度下分别为12.97%、19.05%和22.01%，其中，Alcaligenes、Acinetobacter和Pseudomonas能够耐受高DO浓度、高NH4+-N浓度，且具有高效同步硝化反硝化能力[37]，这3种HN-AD菌属在生物膜内层为高DO浓度时的相对丰度较低DO浓度分别提高了0.19%、3.93%和2.09%. 上述结果说明，提高生物膜内层DO浓度能够促进MABR中HN-AD菌属的富集，强化MABR处理高NH4+-N废水的脱氮性能.

图7 MABR中HN-AD菌属的相对丰度

2.4 脱氮功能基因预测分析

采用基于16s rRNA基因分析的PICRUSt1软件，考察生物膜层DO浓度对MABR中脱氮功能基因丰度的影响(见图8)，获得与硝化过程相关的羟胺氧化酶基因(hao)，该基因为NH2OH氧化生成NO2-过程的功能基因[38]. 不同进气量条件下，MABR中hao基因相对丰度无显著变化，说明改变进气量调节生物膜层DO浓度对MABR中NH2OH氧化过程的影响较小. 此外，还获得与反硝化过程相关的9个功能基因，包括硝酸还原酶基因(narG、narH、narI、napA、napB)、亚硝酸还原酶基因(nirK)、一氧化氮还原酶基因(norB、norC)和一氧化二氮还原酶基因(nosZ). 生物膜内层为高DO浓度(进气量为1.0 L/min)时，反硝化功能基因总相对丰度是低DO浓度(进气量为0.1 L/min)时的9.4倍，说明提高生物膜内层DO浓度有助于增强MABR的反硝化活性. 其中，napA和napB是好氧反硝化过程的关键功能基因[39]，二者在进气量分别为0.1、0.6和1.0 L/min(生物膜内层分别为低、中和高DO浓度)时，其总相对丰度分别为0.000 13‰、0.019‰和0.060‰，高DO浓度时好氧反硝化功能基因(napA和napB)的相对丰度是低DO浓度的462倍. 上述结果说明，提高生物膜内层DO浓度更有利于加快好氧反硝化进程，促进MABR中HN-AD过程的实现.

3 结论

a) 提高进气量增加了MABR生物膜内层DO浓度，拓宽了生物膜内部好氧区域；低、中和高DO浓度水平时，NH4+-N去除率分别为43.64%、60.06%和71.79%，TN去除率分别为41.72%、54.62%和65.90%. 提高生物膜内层DO浓度增强了MABR的脱氮性能.

b) 随着生物膜内层DO浓度的增加，MABR中传统硝化和反硝化菌属的相对丰度降低，但MABR共富集13种HN-AD菌属，其总相对丰度在低、中和高DO浓度下分别为12.97%、19.05%和22.01%，提高生物膜内层DO浓度有利于MABR中HN-AD菌属富集.

c) 生物膜内层在高DO浓度(进气量为1.0 L/min)时反硝化功能基因的总相对丰度是低DO浓度(进气量为0.1 L/min)的9.4倍，其中，高DO浓度时好氧反硝化功能基因(napA、napB)相对丰度是低DO浓度的462倍. 提高生物膜内层DO浓度能够加快好氧反硝化进程，促进MABR中HN-AD过程的实现.