益心泰有效组分对慢性心力衰竭兔心功能及肾脏组织形态的影响研究

魏佳明，李 雅，郭志华，匡 琳，李 卉

(湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

慢性心力衰竭是一组以高发病率、高病死率为特点的临床综合征，且心力衰竭过程中伴随着肾脏病理损伤，目前尚无特异性治疗方法[1-3]。中医药治疗具有整体观念及多靶点、多途径调控优势，治疗该类患者疗效逐渐得到认可[4-5]，值得深入挖掘。益心泰是根据中医理论创制的临床科研方，前期研究已证实益心泰有效组分能提高心肌梗死后心力衰竭兔的心功能，改善心肌病理结构[6]。本研究拟通过观察益心泰有效组分对慢性心力衰竭兔血清心钠素(ANP)水平、心脏超声指标及心脏指数、肾脏指数、肾脏病理结构的影响，进一步探究益心泰有效组分治疗慢性心力衰竭的价值，为其临床应用提供更多实验依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 体重1.5～2.0 kg的普通级健康新西兰兔120只，雌雄各半，购自湖南太平生物科技有限公司，动物许可证编号：SCXK(湘)2015-0004，合格证号：NO.43608300000615。兔分笼饲养，自由进食水，光/暗周期12h/12h(光照时间6:00—18:00)，室温23 ℃左右，湿度52%～60%，通风。该实验得到湖南中医药大学动物实验伦理审查委员会批准(LL2018010801)。

1.2实验药物 益心泰有效组分：黄芪、丹参、红花、猪苓、泽泻购自湖南中医药大学第一附属医院，按照3∶1∶1.5∶1∶1配比，采用系统溶剂法与大孔树脂吸附法相结合，对益心泰复方中4个不同极性部位的药效组分进行分离，根据最佳工艺条件，分离得到益心泰有效组分提取液，冷冻干燥得提取物(含总皂苷372.4 mg/g、总黄酮98.3 mg/g、总多糖445.8 mg/g)；氯沙坦钾，杭州默沙东制药有限公司，国药准字H20000371，规格：50 mg/片；丙基硫氧嘧啶，苏州东瑞制药有限公司，国药准字H32020795，规格：50 mg/片；乌拉坦，Sigma，货号：94300；生理盐水，四川科伦药业股份有限公司，国药准字H51021158，规格：500 mL/瓶。

1.3实验试剂与仪器 ANP ELISA检测试剂盒(江莱生物，货号：JL22215)；多聚甲醛(Sigma，货号：16005)；苏木精(Sigma，货号：H9627)；伊红(Sigma，货号：E4009)；石蜡(河南天孚化工有限公司)；超声心动图机(西门子公司，货号：Sequoia 512)；RM2235石蜡轮转切片机(Leica公司)；电子秤(湘仪天平仪器设备有限公司)。

1.4实验方法 随机选择健康兔20只作为正常对照组，其余100只以阿霉素耳缘静脉注射+丙基硫氧嘧啶灌胃方法制作慢性心力衰竭模型：将兔固定于手术台上，按照兔进食量的0.2%予以丙基硫氧嘧啶灌胃，每日1次，并分别于每周三、周日下午耳缘静脉注射浓度为1 mg/mL的阿霉素溶液1 mg/kg；正常对照组予等次等量的生理盐水灌胃与耳缘静脉注射。连续造模8周后，以兔心率及呼吸频率升高，精神萎靡，抓起反抗下降，耳温及尿量减少，伴有水肿表现，血清ANP水平及左心室收缩末期内径(LVIDs)、左心室舒张末期内径(LVIDd)显著升高为造模成功。造模过程中共有16只兔死亡，均死于腹泻。将造模成功的兔按完全随机设计方法分为模型组(17只)、益心泰有效组分低剂量组(17只)、益心泰有效组分中剂量组(17只)、益心泰有效组分高剂量组(17只)和氯沙坦钾组(16只)，益心泰有效组分低、中、高剂量组分别给予2.1 g/(kg·d)、4.2 g/(kg·d)和8.4 g/(kg·d) (根据成人体表面积换算法，结合临床用药经验和既往实验研究确定给药剂量，相当于临床剂量的2,4,8倍)的益心泰有效组分灌胃，氯沙坦钾组给予2.75 mg/(kg·d)的氯沙坦钾悬液灌胃，正常对照组与模型组灌胃同等容积的蒸馏水，各组灌胃量均为每次10 mL/kg，均每日1次，连续4周。

1.5观察指标及方法

1.5.1一般情况 观察各组兔毛色、精神状态、心率、呼吸频率、耳温、尿量、水肿等一般情况。

1.5.2血清ANP水平 采用ELISA法检测：灌胃结束后麻醉兔，心脏采血，静置，离心，稀释，过夜，洗涤。加入待测血清样品，反复孵育，洗涤，最后每孔加入0.05 mL 2 mol/L H2SO4，终止反应。使用酶标仪检测450 nm处的OD值并记录。

1.5.3心脏超声 麻醉满意后将兔平卧位固定，运用西门子Sequoia 512超声心动图机(探头频率3～8 MHz)，于心前区取左室长轴最大直径处，M型超声标记室间隔和左室后壁收缩末期与舒张末期心内膜位置，随机软件自动计算兔LVIDs及 LVIDd，取5个心动周期读数平均值。

1.5.4心脏指数及肾脏指数 空气栓塞法处死兔后，称重记录，开胸，取心脏、肾脏，洗尽血液，剪去残余大血管，滤纸吸干后称重记录。按脏器指数=脏器重量/体重公式计算心脏指数、肾脏指数。

1.5.5肾脏组织形态学 处死兔后，取部分肾脏组织，4%多聚甲醛固定组织并修整，经梯度乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋，制备切片(厚4～5 μm)，烤片，HE染色，光镜观察并采图。

2 结 果

2.1各组兔一般情况 模型组兔精神状态、心率、呼吸频率、耳温、尿量、水肿等一般情况没有明显改变，其中部分兔较前严重；益心泰有效组分低、中、高剂量组及氯沙坦钾组上述情况逐渐较前好转，其中益心泰有效组分中、高剂量组和氯沙坦钾组改善更明显。整个灌胃过程中，模型组和益心泰有效组分低剂量组各3只、益心泰有效组分中剂量组2只、益心泰有效组分高剂量组和氯沙坦钾组各1只死亡，均死于腹泻；正常对照组无兔死亡。

2.2各组兔血清ANP水平比较 正常对照组、模型组、益心泰有效组分低剂量组、益心泰有效组分中剂量组、益心泰有效组分高剂量组与氯沙坦钾组血清ANP水平分别为(62.19±1.67)ng/mL、(155.40±4.16)ng/mL、(138.68±3.18)ng/mL、(126.98±3.09)ng/mL、(125.03±3.54)ng/mL、(124.69±3.26)ng/mL，模型组明显高于正常对照组(P<0.05)，益心泰有效组分低、中、高剂量组与氯沙坦钾组均明显低于模型组(P均<0.05)，益心泰有效组分中、高剂量组和氯沙坦钾组均明显低于益心泰有效组分低剂量组(P均<0.05)，益心泰有效组分中、高剂量组与氯沙坦钾组之间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.3各组兔心脏超声指标比较 模型组LVIDs、LVIDd均明显高于正常对照组(P均<0.05)，益心泰有效组分低、中、高剂量组与氯沙坦钾组均明显低于模型组(P均<0.05)，益心泰有效组分中、高剂量组和氯沙坦钾组均明显低于益心泰有效组分低剂量组(P均<0.05)，益心泰有效组分中、高剂量组与氯沙坦钾组之间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。 见表1。

表1 正常对照组和慢性心力衰竭各组兔心脏超声指标比较

2.4各组兔心脏指数、肾脏指数比较 模型组心脏指数、肾脏指数均明显高于正常对照组(P均<0.05)，益心泰有效组分低、中、高剂量组与氯沙坦钾组均明显低于模型组(P均<0.05)，益心泰有效组分中、高剂量组和氯沙坦钾组均明显低于益心泰有效组分低剂量组(P均<0.05)，益心泰有效组分中、高剂量组与氯沙坦钾组之间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 正常对照组和慢性心力衰竭各组兔心脏指数、肾脏指数比较

2.5各组兔肾脏组织形态比较 正常对照组兔肾脏组织形态结构正常，未见病理改变；模型组兔肾小球体积增大、肿胀，肾小管上皮呈现空泡样变、管腔变大，间质水肿，大量炎细胞浸润；益心泰有效组分低、中、高剂量组和氯沙坦钾组以上情况较模型组依次有不同程度的减轻。见图1。

图1 正常对照组和慢性心力衰竭各组兔肾脏组织形态(HE，×400)

3 讨 论

慢性心力衰竭病程缠绵，“久病多虚”“久病多瘀”“久病及肾”。中医认为慢性心力衰竭的主要病机为气虚、血瘀、水停，其病机与心肾二脏密切相关。《素问·灵兰秘典论》指出：“心者，君主之官也，神明出焉……肾者，作强之官，技巧出焉。”心为阳脏，肾为水脏，二者互相沟通滋养，“水火既济”。若心肾阳气失于互资，则血瘀加重，水湿不化，饮邪内停，导致心力衰竭。慢性心力衰竭以呼吸困难、水肿和乏力为主要临床表现。肾为先天之本，元气之根，肾气充盛才能发挥主司纳气作用，肾气不固则呼吸困难，元气不足则惫懒乏力，肾主水功能失权则发为水肿。研究表明，基于“心肾相关”防治慢性心力衰竭理论详实、疗效可靠[7-9]。益心泰由黄芪、红花、丹参、猪苓、泽泻等药物组成，方中以黄芪为君，善补气升气、利水消肿，为治疗气虚水肿尿少之要药。丹参活血化瘀，泽泻利水渗湿，共为臣药。佐以红花活血通经、祛瘀止痛，猪苓利水消肿。诸药配伍，共奏益气活血利水之功。本方在处理阴阳上，主要以温补阳气为主；在处理气血上，主要以补气为主、活血为辅；在处理脏腑关系上，主要以治疗肾、心两脏为核心。前期研究证实益心泰可改善慢性心力衰竭兔超声心动图指标，可抑制心肌组织原癌基因C-Myc表达，改善心功能[10-11]。

本实验选用阿霉素耳缘静脉注射+丙基硫氧嘧啶灌胃法制备兔慢性心力衰竭模型，操作简便，易于表现出慢性心力衰竭的疾病特点，不过阿霉素具有导致腹泻作用，可能是导致实验中兔大量死亡的原因，与文献[12]研究结果一致。造模后，模型组兔血清ANP水平及LVIDs、LVIDd、心脏指数、肾脏指数较正常对照组明显升高，提示慢性心力衰竭兔心功能下降及心脏、肾脏发生病理性改变；与模型组比较，各给药组血清ANP水平及LVIDs、LVIDd、心脏指数、肾脏指数明显降低，说明益心泰有效组分能提高慢性心力衰竭兔心功能，减轻心脏、肾脏的病理性损伤。

综上，益心泰有效组分在改善慢性心力衰竭兔心功能的同时减轻了其肾脏病理结构的损伤，在丰富了益心泰有效组分实验研究内容的同时，为从“心肾相关”角度阐释益心泰的作用机制提供了实验依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。