尾叶香茶菜水煎液对实验性牙周炎大鼠的治疗作用

杨丽霞，冯婷婷，李思思

（山西中医药大学中药与食品工程学院，山西晋中030619）

牙周炎是累及4 种牙周组织的慢性感染性疾病［1］，主要临床表现是牙龈炎症、出血、牙周袋形成、牙齿松动移位、咀嚼无力，严重者可自行脱落或导致牙齿拔出［2］，是我国成年人丧失牙齿的首位原因［3］。目前，临床上用于治疗牙周炎的方法主要是采用机械治疗配合全身和局部应用抗生素，然而长期应用抗生素会导致机体菌群失调，产生耐药性，并且容易造成变态反应［4］，使其在临床应用中受到一定限制［5］。目前中草药因其副作用小、标本兼治、价格低廉引起许多学者在中医药治疗牙周炎领域进行探索。

尾叶香茶菜为唇形科香茶菜属多年生草本植物，又名龟叶草、狗日草、野苏子，始载于《中国植物志》［6］，在我国的黑龙江、吉林、辽宁及山西等省份有大面积的野生资源分布。尾叶香茶菜全草入药，具有清热解毒、健胃、活血等功效［7］。前期研究证实，尾叶香茶菜水煎液具有明显抗炎镇痛作用［8］，对口腔常见致病菌具有明显抑菌作用，对牙周致病菌具有明显抑制作用［9］。本研究在前期研究基础上建立大鼠牙周炎动物模型，以尾叶香茶菜水煎液进行治疗，通过对大鼠牙周炎临床指标及牙龈组织和血清中炎症因子水平的检测，考察尾叶香茶菜水煎液对实验性牙周炎大鼠的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF 级雄性SD 大鼠80 只，体质量（180±20）g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司［许可证号：SCXK（沪）2013-0016］，在上海市实验动物检测中心检验合格。本实验通过山西中医药大学实验动物伦理委员会批准，实验均符合中国伦理委员会有关动物研究指导原则。

1.1.2 实验药物 尾叶香茶菜药材采自辽宁省本溪市汤沟，经鉴定为唇形科香茶菜属植物尾叶香茶菜［Rabdosia excisa（Maxim.）Hara］的地上部分。人工牛黄甲硝唑胶囊（江西药都仁和制药有限公司，批号181105）；水合氯醛（天津市大茂化学试剂厂，批号 20191008）；1L-1β、IL-6、TNF-α 酶联免疫检测试剂盒（上海泛柯实业有限公司）；DNM-9602 酶标仪（北京普朗新技术有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 尾叶香茶菜水煎液的制备 称取尾叶香茶菜干叶200 g，粉碎，过筛，加蒸馏水至浸过药面3 cm，使水浸透药物组织，浸泡30 min，有利于药效成分煎出。先用大火煎煮至沸，后用小火保持微沸状态煎煮30 min，滤取药液100 mL 放入无菌瓶中；二煎同上，滤取药液100 mL；将2 次煎煮所得药液混合后继续煎煮浓缩至1 mL 药液含生药1 g［8-9］。

1.2.2 牙周炎动物模型的建立 用10%的水合氯醛1 mL/300 g 腹腔注射麻醉大鼠，固定大鼠四肢，牵拉口角，用探针将大鼠双侧上颌第一磨牙牙周与牙根面分离，用直径0.2 mm 正畸钢丝结扎大鼠第一磨牙牙颈部，使结扎丝位于龈下，腭侧打结，剪去多余钢丝，并喂养10%的蔗糖水和用蔗糖水浸泡过的软饲料［10-12］。6 周后大鼠牙周组织出现牙龈红肿、出血及牙齿松动等牙周炎症状表明牙周炎动物模型建成［12］。

1.2.3 分组与给药 80 只SD 大鼠中选取牙体牙列完整，无龋坏及牙周病的10 只大鼠作为空白对照组（正常组），采取正常饲养，不给予任何干预。其余牙体牙列完整，无龋坏及牙周病的大鼠用来建造牙周炎动物模型。6 周后，选取50 只造模成功大鼠将其随机分为5 组，模型组10 只，阳性对照组10 只、实验低、中、高剂量组各10 只，在基础麻醉下去除结扎丝，对实验牙进行手工洁治，正常饮食，模型组不给予药物治疗，阳性对照组灌胃人工牛黄甲硝唑胶囊0.13 g/kg，实验低、中、高剂量组分别灌胃尾叶香茶菜水煎液2 g/kg、4 g/kg、8 g/kg（相当于生药材量），1 次/d，持续给药 3 周。

1.2.4 牙周组织临床指标观察 参照文献［13-17］，检查各组大鼠的牙龈指数、出血指数、牙齿松动度和菌斑指数4 项临床指标。牙龈指数（gingival index，GI）：将牙周探针放到牙龈边缘龈沟开口处，并沿龈缘轻轻滑动，牙龈组织只被轻微地触及。按照不同程度记 0~4 分，0 分为正常牙龈；1 分为牙龈略有水肿，探针探之不出血；2 分为牙龈水肿，并探诊出血；3 分为牙龈有自发出血倾向或溃疡。出血指数（bleeding index，BI）：用钝头牙周探针轻探入龈沟，取出探针30 s 后，观察有无出血及出血程度。按照不同程度记0~5 分，0 分为牙龈健康，无炎症及出血；1 分为牙龈颜色有炎症性改变，探针不出血；2 分为探针后有点状出血；3 分为探针出血沿牙龈缘扩散；4 分为出血流满并溢出龈沟；5 分为自动出血。牙齿松动度（tooth mobility degree，TMD）：闭合镊子，用镊子尖端抵住颊面窝，向颊舌或近远中方向摇动。分为I~Ⅲ度记录，I 度为松动超过生理松动度，但幅度在1 mm 以内；Ⅱ度为松动幅度1~2 mm；Ⅲ度为松动幅度在2 mm 以上。菌斑指数（plaque index，PLI）：用菌斑显示剂涂布于牙面，冲洗后再检查着色的菌斑在牙面的分布部位和范围。按照不同程度记0~5 分，0 分为牙面无菌斑；1 分为牙颈部龈缘处有散在的点状菌斑；2 分为牙颈部连续窄带状菌斑宽度不超过1 mm；3 分为牙颈部菌斑覆盖面积超过1 mm，但少于牙面1/3；4 分为菌斑覆盖面积至少占牙面1/3，但不超过2/3；5 分为菌斑覆盖面积占牙面 2/3 或 2/3 以上。

1.2.5 牙龈组织中 1L-1β、IL-6、TNF-α 含量的测定 麻醉大鼠，剥离大鼠右上第一磨牙牙龈组织，清洗，称重后加入9 倍体积0.9%生理盐水，匀浆，离心，取上清液得10%牙龈组织匀浆液。按照ELISA 试剂盒说明书加样，温育，洗涤，加酶，终止，测定，计算样品中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的浓度。剥离大鼠左上第一磨牙牙龈组织，清洗，滤纸吸水，浸入10%中性福尔马林中固定，备用。

1.2.6 血清中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量测定 将大鼠固定好，用50 ℃温水浸泡尾部2 min，血管充血后，棉球消毒、擦干鼠尾，用消毒手术剪剪去尾尖5~10 mm，然后从尾根部向尾尖按摩，血自尾尖流出，可采1.5~2 mL 血液。尾尖采血后轻轻倒转采血管混合4~5 次，直立置于室温待血液完全凝固，离心10 min，分离血清。将采集好的血清转移至单独的冻存管，冷冻备用。严格按照ELISA 试剂盒说明书测定血清中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量。

1.3 统计学方法

应用SPSS 19.0 统计软件进行分析。计量数据用标准±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 牙周组织临床指标检查结果

与正常组比较，模型组 GI、BI、TMD、PLI 均明显升高（P<0.01）。与模型组比较，阳性对照组和尾叶香茶菜高剂量组4 项临床指标均明显降低（P<0.01），中剂量组 GI、BI、TMD，3 项临床指标明显降低（P<0.01），低剂量组 BI 明显降低（P<0.01）。与尾叶香茶菜低剂量组比较，高剂量组4 项临床指标均明显降低（P<0.01），中剂量组 GI、BI、TMD明显降低（P<0.05，P<0.01）。与尾叶香茶菜中剂量组比较，高剂量组 GI、BI、PLI 明显降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表1。

表1 各组大鼠牙周组织牙龈指数、出血指数、牙齿松动度、菌斑指数比较 （）

表1 各组大鼠牙周组织牙龈指数、出血指数、牙齿松动度、菌斑指数比较 （）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01；与低剂量组比较，3）P＜0.05，4）P＜0.01；与中剂量组比较，5）P＜0.05，6）P＜0.01

组别 n GI BI TMD PLI正常组 10 0.00±0.00 0.00±0.00 1.00±0.00 0.60±0.52模型组 10 2.20±0.421） 3.20±0.421） 2.60±0.521） 1.90±0.321）阳性对照组 10 0.70±0.482） 0.60±0.522） 1.10±0.322） 1.00±0.472）尾叶香茶菜低剂量组 10 1.90±0.32 2.10±0.322） 2.20±0.42 1.70±0.48尾叶香茶菜中剂量组 10 1.30±0.482）4） 1.40±0.522）4） 1.60±0.522）3） 1.50±0.53尾叶香茶菜高剂量组 10 0.90±0.322）4）5） 0.80±0.422）4）5） 1.30±0.482）4） 0.90±0.322）4）6）

2.2 牙龈组织中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的水平比较

与正常组比较，模型组牙龈组织中1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量均明显升高（P<0.01）。与模型组比较，阳性对照组、尾叶香茶菜高、中剂量组牙龈组织中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量均明显降低（P<0.01），低剂量组牙龈组织中1L-1β 的含量明显降低（P<0.01）。与尾叶香茶菜低剂量组比较，高、中剂量组牙龈组织中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量均明显降低（P<0.01）。与尾叶香茶菜中剂量组比较，高剂量组牙龈组织中1L-1β、TNF-α 的含量明显降低（P<0.01，P<0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠牙龈组织相关炎症指标比较（）

表2 各组大鼠牙龈组织相关炎症指标比较（）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01；与低剂量组比较，3）P＜0.01；与中剂量组比较，4）P＜0.05，5）P＜0.01

组别n剂量1L-1β/（pg/mL）IL-6/（pg/mL）TNF-α/（pg/mL）正常组 10 - 9.61±0.87 83.62±8.94 4.17±0.63模型组 10 - 43.16±5.791） 246.65±47.571） 16.90±2.561）阳性对照组 10 0.13 g/kg 14.75±1.862） 110.65±14.302） 8.05±1.202）尾叶香茶菜低剂量组 10 2 g/kg 35.52±3.192） 212.66±30.02 15.06±1.38尾叶香茶菜中剂量组 10 4 g/kg 28.22±3.232）3） 152.40±41.362）3） 11.39±1.282）3）尾叶香茶菜高剂量组 10 8 g/kg 19.56±2.882）3）5） 126.07±22.702）3） 10.03±1.202）3）4）

2.3 血清中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的水平比较

与正常组比较，模型组血清中1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量均明显升高（P<0.01）。与模型组比较，阳性对照组、尾叶香茶菜高、中剂量组血清中1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量均明显降低（P<0.01），低剂量组血清中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量明显降低（P<0.01，P<0.05）。与尾叶香茶菜低剂量组比较，高剂量组血清中 1L-1β、IL-6、TNF-α 的含量均明显降低（P<0.01），中剂量组血清中IL-6、TNF-α的含量明显降低（P<0.05）。与尾叶香茶菜中剂量组比较，高剂量组血清中1L-1β、TNF-α 的含量明显降低（P<0.01）。结果见表3。

表3 各组大鼠血清中相关炎症指标检测结果（）

表3 各组大鼠血清中相关炎症指标检测结果（）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01；与低剂量组比较，4）P＜0.05，5）P＜0.01；与中剂量组比较，6）P＜0.05

组别n剂量1L-1β/（pg/mL）IL-6/（pg/mL）TNF-α/（pg/mL）正常组 10 - 13.89±1.11 99.12±8.47 5.10±0.76模型组 10 - 53.96±7.241） 258.55±39.641） 21.96±3.331）阳性对照组 10 0.13 g/kg 18.96±2.393） 142.55±16.683） 8.85±1.333）尾叶香茶菜低剂量组 10 2 g/kg 44.40±3.993） 211.10±27.833） 18.68±2.292）尾叶香茶菜中剂量组 10 4 g/kg 40.32±4.603） 167.64±45.503）4） 16.09±1.933）4）尾叶香茶菜高剂量组 10 8 g/kg 22.35±3.293）5）6） 141.03±21.793）5） 10.43±1.733）5）6）

3 讨 论

本实验选用的阳性对照药人工牛黄甲硝唑胶囊是复方制剂，每粒含甲硝唑200 mg，人工牛黄5 mg，用于急性智齿冠周炎、局部牙槽脓肿、牙髓炎、根尖周炎等，高剂量时可引起癫痫发作和周围神经病变，长期用药可产生持续性周围神经病变。人工牛黄甲硝唑胶囊为抗厌氧菌药，其中的甲硝唑对大多数厌氧菌具有强大抗菌作用，长期服用会使全身菌群失调、引起耐药菌感染等。尾叶香茶菜水煎液对多数口腔常见致病菌有不同程度的抑菌作用，对厌氧菌的作用与舒康口腔喷剂相当，对变形杆菌、中间型普氏菌的作用则强于甲硝唑［9］，同时尾叶香茶菜水煎液具有清热解毒、抗炎镇痛作用［8］，且副作用较少。本实验采用尾叶香茶菜水煎液治疗慢性牙周炎，以观察其对慢性牙周炎临床指标的影响，为采用中医中药辅助治疗慢性牙周炎提供临床参考。本实验正常组大鼠牙龈健康，无炎症及出血，牙面无菌斑或牙颈部龈缘处有散在点状菌斑，牙齿松动度Ⅰ度。造模6 周后，模型组实验牙牙龈红肿，质地松软，探诊出血沿牙龈缘扩散，牙颈部出现连续窄带状菌斑，牙齿松动度Ⅱ~Ⅲ度。灌胃3 周后，尾叶香茶菜高剂量治疗组实验牙牙龈略有水肿，探针探之不出血，牙颈部龈缘处有散在点状菌斑，牙齿松动度Ⅰ~Ⅱ度，4 项临床指标均明显降低，表明高剂量治疗组牙周状态有所改善。

牙周炎作为感染性疾病，其始动因子是牙菌斑［18-19］，牙周细菌产生的毒素、抗原成分、代谢产物等可刺激上皮细胞产生 IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎症因子，IL-1β 可促进 IL-6、TNF-α 等表达。正常水平的IL-6 有保护机体的作用，但当炎症局部IL-6 达到一定水平时就会破坏牙槽骨，抑制牙周主体细胞生长，加重牙周组织炎症；同时TNF-α可激活破骨细胞，从而破坏牙周组织，引发牙周炎；IL-1β 可通过直接产生或促进IL-6 产生大量的蛋白酶和PGE2 等破坏牙周组织。这些炎症因子之间协同作用，共同参与牙周组织的破坏。本实验模型组右上第一磨牙牙龈组织和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 炎症因子水平均明显高于正常组，尾叶香茶菜高、中剂量对3 项炎症因子水平均有明显降低作用。说明尾叶香茶菜水煎液高、中剂量能够抑制大鼠牙龈组织和血清中炎症因子1L-1β、IL-6、TNF-α 释放，减轻牙周组织炎症，减缓牙周组织破坏，且具有浓度依赖性。