五味子乙素通过抗氧化和保护结肠屏障改善帕金森病模型小鼠的运动功能

贾 璐 ，徐幸杰 ，樊慧杰 ，王 青 ，李彦青 ，杭 薇 ，王惠洁 ，郭敏芳 ，肖保国 ，柴 智 ，马存根 ，

（1.山西中医药大学多发性硬化益气活血重点研究室神经生物学研究中心，山西晋中030619；2.山西大同大学脑科学研究所，山西大同037009； 3.复旦大学华山医院神经病学研究所，上海200025）

帕金森病（PD）是一种在中老年人群中发病率仅次于阿尔兹海默病的神经退行性疾病，该病的临床表现除运动功能障碍外，还常伴有消化功能紊乱［1］。在 PD 患者和 PD 模型小鼠体内，不仅存在中脑黑质的典型病变，也检测到肠道氧化应激、炎症增强、肠黏膜屏障功能受损等异常的生理现象［2-4］。五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是五味子的一种重要成分，在多种疾病模型中被证实具有神经保护作用［5-7］。但Sch B 能否将肠道作为靶标保护PD 小鼠仍是未知。因此，本研究拟建立1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）诱导的PD 小鼠模型，通过检测小鼠的行为学改变及结肠氧化应激指标和结肠上皮屏障功能相关蛋白变化，聚焦肠道来探究Sch B 对PD 小鼠的治疗效果及潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 30 只体质量为20～25 g 的雄性C57BL/6 小鼠（8~10 周龄）购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006。动物在温度、湿度适宜的环境中适应性饲养1 周后进行实验。

1.1.2 试剂与仪器 Sch B 购自成都曼斯特生物科技有限公司；MPTP 购于美国 Sigma 公司；丙二醛（Malonaldehyde，MDA）和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）试剂盒购于南京建成生物工程研究所；ZO-1（ab276131）抗体购自英国 Abcam 公司；Occludin（27260-1-AP）抗体购自美国 Proteintech 公司；βactin（AP0060）抗体购自美国 Bioworld 公司；HRP羊抗兔IgG（BA1054）购自武汉博士德生物工程有限公司。多功能酶标仪购自美国Molecular Devices 公司，凝胶成像仪购自上海天能科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与造模 将小鼠随机分为正常组（Normal group）、模型组（Model group）和 Sch B（Sch B group）治疗组，每组10 只。模型组与Sch B 组每日腹腔注射MPTP 1 次，共7 d（第1 天注射剂量为25 mg/kg，第 2 天注射剂量为 20 mg/kg，第 3~7 天注射剂量为 30 mg/kg），正常组腹腔注射等量生理盐水［8］。

1.2.2 给药 将Sch B 溶于0.5 %羧甲基纤维素钠，自造模第1 天起，Sch B 组小鼠每日按照80 mk/kg 剂量予以 Sch B 灌胃（0.2 mL），正常组和模型组给予等体积羧甲基纤维素钠灌胃，给药共持续2 周。

1.2.3 悬挂实验 将小鼠双前爪置于直径约为2 mm 的水平电线之上，使小鼠处于悬挂状态。若小鼠双后爪均能抓住电线记为3 分，若小鼠仅有一只后爪能抓住电线记为2 分，若小鼠双后爪均无法抓握电线则记为 1 分［9］。

1.2.4 取材与氧化因子检测 腹腔注射0.2 %水合氯醛麻醉小鼠，迅速取出结肠组织，称重后按照质量∶体积=1∶9 加入0.9%生理盐水，在冰上用组织匀浆器充分研磨，3000 rpm 离心15 min 取上清，按照试剂盒说明书步骤，采用比色法测定各组小鼠结肠组织上清中MDA 和GSH 含量。

1.2.5 Western blot 检测 ZO-1 与 Occludin 表达结肠组织称重，按照质量∶体积=1∶9 加入RIPA 裂解液，利用组织匀浆器在冰上提取结肠蛋白，BCA法测定蛋白浓度。各组结肠蛋白经SDS-PAGE 凝胶电泳分离后湿转至PVDF 膜，5%脱脂奶室温封闭 1 h，ZO-1、Occludin 和 β-actin 一抗 4 ℃孵育过夜。次日用PBS 洗膜3 次后，室温孵育二抗2 h，化学发光液显影，用Image J 软件进行灰度值分析。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0 软件进行数据分析，结果以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较使用Turkey-t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠悬挂评分比较

与正常组比较，模型组小鼠肌僵直严重、震颤明显，悬挂评分显著下降（P＜0.001），符合 PD 的典型临床特征。经Sch B 治疗后，小鼠的悬挂评分明显提高（P＜0.01），见图 1。表明 Sch B 能够改善PD 小鼠的运动协调性，缓解运动功能障碍。

图1 各组小鼠悬挂评分比较

2.2 各组小鼠结肠组织MDA 和GSH 水平比较

与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中MDA含量升高（P<0.05），GSH 水平下降（P<0.01）；与模型组比较，Sch B 组小鼠结肠组织中MDA 含量下降（P<0.01），GSH 水平上升（P<0.05），见图 2。表明Sch B 可缓解PD 小鼠结肠的氧化应激损伤。

图2 各组小鼠结肠组织中MDA、GSH 水平比较

2.3 各组小鼠结肠组织ZO-1、Occludin 表达比较

与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中ZO-1、Occludin 的表达均显著降低（P<0.001，P<0.01）；与模型组比较，Sch B 组小鼠结肠组织中ZO-1、Occludin 的表达均显著升高（P<0.01，P<0.05），见图3。表明Sch B 能够在一定程度上缓解PD 小鼠结肠组织ZO-1 和Occludin 的丢失。

图3 各组小鼠结肠组织中ZO-1 和Occludin 蛋白表达量比较

3 讨 论

Sch B 是从中药五味子中分离出的一种有效成分，在抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗焦虑等方面都起着至关重要的作用。研究表明，Sch B 可以增强细胞中超氧化物歧化酶活性，提高GSH 抗氧化系统水平，激活谷胱甘肽S-转移酶、谷胱甘肽还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性，并抑制脂质过氧化，减少乳酸脱氢酶和MDA 释放，从而发挥抗氧化作用［10］。近来 Wu Ying 等［11］报道，在急性氧化应激造成的神经损伤疾病模型中，Sch B 能够通过靶定Nrf2 通路减少活性氧类（Reactive oxygen species，ROS）和 MDA 产生，同时上调 GSH 水平，从而提高中枢神经系统神经元的抗氧化能力。此外，Sch B 对阿尔兹海默病模型小鼠的预防保护作用也与其激活Nrf2 信号通路提高抗氧化酶活性有关［7］。在抑郁症和 2 型糖尿病模型中，Sch B 均能够上调大鼠体内超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性，并减少 MDA 产生，从而缓解疾病［6，12］。因此，作为一种低毒性、低成本的天然非酶抗氧化剂，Sch B 具有广泛的应用前景。

PD 是一种以运动功能障碍为主要特征的神经退行性疾病。MPTP 是一种常用于PD 造模的神经毒素，MPTP 作为一种高度亲脂的分子，很容易穿过血脑屏障，然后由星形胶质细胞中的单胺氧化酶 B 转化为 1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+），MPP+通过多巴胺转运体进入多巴胺能神经元，抑制线粒体电子转运链的复合物I，阻止三磷酸腺苷（ATP）合成，最终导致细胞死亡［13］。鉴于 MPTP 能够选择性并快速地破坏黑质纹状体中的多巴胺能神经元，复制出与PD 相关的功能缺陷，它已被广泛运用于各种模型动物的PD 模型制备。在本项研究中，我们采用MPTP 连续7 d 腹腔注射制造PD 小鼠模型，造模后第14 天，通过悬挂实验检测小鼠行为学改变。我们观察到模型组小鼠肌僵直、震颤明显，后爪的抓握能力明显比正常组差，悬挂得分与正常组比较差异具有统计学意义，提示造模成功，使小鼠出现了PD 的典型临床症状——运动功能障碍。经过2 周Sch B 灌胃治疗后，小鼠的肌僵直和震颤有所缓解，后爪的抓握能力明显优于模型组，表明Sch B 能够有效改善PD 小鼠的运动功能。

目前，关于PD 的发病机制尚无准确定论。多数学者认为，PD 的发生是环境因素、氧化应激、炎症等共同作用的结果。肠道功能紊乱是PD 重要的非运动性症状，临床数据显示，80%的PD 患者都伴有便秘现象［14］，PD 肠道病理生理症状的出现甚至早于运动功能障碍，因此有学者认为PD 的发生与肠道密切相关，甚至PD 的起病就在于肠道［15-16］。来自早期PD 患者的数据表明，氧化应激水平的升高是PD 初始阶段的一个重要特征，发生在明显的神经元丢失之前［17］。研究发现，过度氧化不仅多发生于PD 患者和PD 模型动物脑内，也存在于肠道［18-19］。在本实验中，我们检测到模型组小鼠结肠组织中GSH 和MDA 这两个氧化应激重要指标的水平均发生了显著变化。GSH 是机体氧化防御体系的一个重要成员，模型组小鼠结肠组织中GSH 水平的下降表明PD 小鼠肠道的抗氧化能力有所减弱，MDA 含量增加则反映肠道出现了过度的脂质过氧化，二者共同说明MPTP 诱导的PD 小鼠结肠确实发生了氧化应激，这与之前的报道一致［20-21］。经 Sch B 干预后，PD 小鼠结肠中 GSH水平有所增加，MDA 含量显著降低，表明Sch B能够通过靶定PD 小鼠结肠发挥抗氧化作用，减轻结肠的氧化损伤。

越来越多的研究表明，肠上皮屏障损伤在PD的发生发展中扮演着重要的角色［3，22］。肠上皮屏障是肠上皮细胞在血液循环和肠腔内容物之间形成的调节性屏障，其通透性包括旁细胞途径和跨细胞途径［23］。上皮紧密连接是肠上皮屏障最重要的结构之一，它将肠细胞紧密连接在一起，维持肠上皮屏障的旁细胞通透性［24］。研究发现，PD 患者肠道通透性增加，且肠道中Occludin 的表达显著减少［24-26］。Occludin 是一种典型的紧密连接蛋白，它可以通过与ZO-1 相互作用连接到肌动蛋白细胞骨架上，从而促进紧密连接装配，并维持其功能和完整性［27］。在本实验中我们观察到模型组小鼠结肠组织中ZO-1 和Occludin 表达下降，提示MPTP能够损伤小鼠的肠上皮屏障，这一现象与其他团队的研究结果相一致［28］。与模型组比较，Sch B 组小鼠结肠中ZO-1 和Occludin 蛋白水平明显升高，表明Sch B 能够作用于紧密连接，从而对MPTP 诱导的PD 小鼠结肠屏障起到保护作用。

综上所述，我们的研究证实Sch B 能够改善PD 小鼠的运动功能，这可能与其缓解结肠氧化应激损伤及保护结肠屏障功能有关，但其中涉及的具体机制还有待进一步研究。