11501例不同临床指征单胎孕妇NIPT临床应用效力比较*

王 玉，李 娜，张丽华，宋 珍，杨瑞芳，孙 平

(山东大学齐鲁医院妇产科产前诊断中心，济南 250012)

目前，面向低龄、低危孕妇的一线血清学筛查存在检出率偏低、假阳性率高的问题[1]。无创产前检测(non-invasive prenatal testing，NIPT)以对T21、T18、T13具有较高的筛查敏感度和特异度被迅速推广，成为产前血清学筛查-诊断体系的有力补充[2]。行NIPT的孕妇临床指征复杂，如何对不同指征的孕妇进行准确的遗传咨询是临床工作的难点，而NIPT筛查效率及目标疾病发病率的比较对于不同孕妇群体的临床管理具有重要的参考价值。早期大样本的研究多关注NIPT的总体筛查效率，近年来该技术在不同临床指征孕妇群体中的应用逐渐成为研究的焦点，但研究中少见对血清学筛查高风险、T21临界风险孕妇及超声软指标异常的孕妇进行综合分类比较[3-8]。鉴于此，本研究收集并分析了11501例孕妇的NIPT数据，结合产前诊断及新生儿随访等结果，对不同临床指征组中NIPT的筛查效率和目标疾病发病率进行了分析比较，并同时探讨了不同临界风险截断值下目标疾病发病率的差异，以期为NIPT技术的临床应用及临界风险孕妇的管理提供理论支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2015年6月至2020年3月在山东大学齐鲁医院接受NIPT的单胎孕妇11501例，孕龄12+1～29+6周，年龄18～45岁。排除标准：(1)孕周小于12周；(2)夫妇一方有明确染色体异常；(3)有基因遗传病家族史或提示胎儿罹患基因病高风险；(4)影像学检查提示胎儿有结构异常或怀疑胎儿有微缺失、微重复综合征或其他染色体异常需行产前诊断；(5)1年内接受过异体输血或4周内接受过免疫治疗；(6)接受过器官移植、干细胞治疗；(7)孕期合并恶性肿瘤；(8)试管婴儿多胎减至一胎，双胎妊娠其中一胎消亡；(9)重度脂血。本研究经山东大学齐鲁医院科研伦理委员会的批准(批号：KYLL-202008-035)。

1.2 方法

1.2.1 孕妇分组 根据临床指征分为7组：(1)血清学筛查T21高风险组；(2)血清学筛查T18高风险组；(3)血清学筛查T21临界风险组(风险值为1/270～1/1000)；(4)高龄组(预产期年龄≥35周岁)；(5)NT增厚组(NT≥2.5mm)；(6)其它超声软指标异常(主要包括侧脑室增宽、左心室点状强回声、脉络丛囊肿、肠管强回声、鼻骨显示不清等)；(7)无指征组(自愿选择、错过血清学筛查时间等)。除(4)组外，其余组孕妇预产期年龄均小于35周岁。增加3个截断值1/350、1/500、1/750，将血清学筛查T21临界风险组孕妇划分为4个临界风险亚区间。入组孕妇的血清学筛查均采用时间分辨荧光法。

1.2.2 NIPT 采用Cell Free DNA Tube(ARtechTM)，抽取孕妇肘静脉血5mL，孕妇均签署知情同意书。测序仪器为Illumina公司NextSeq 550。测序数据分析采用无创产前胎儿染色体非整倍体分析软件，测序试剂为胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(可逆末端终止测序法)，均为安诺优达基因科技(北京)有限公司开发。仅报告提示为T21、T18、T13高风险的计入阳性结果。自采样后10个工作日内出具临床报告。综合敏感度、特异度和阳性预测值(positive predictive value，PPV)三项指标对NIPT筛查效率进行分析比较。

1.2.3 羊水细胞产前诊断 对NIPT高风险孕妇行羊膜腔穿刺术，抽取羊水21mL，进行染色体核型分析、未培养细胞的荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)检测及染色体微阵列分析(chromosome microarray analysis，CMA)，若孕周超过26周则不做染色体核型分析。羊水细胞培养基购自杭州宝荣科技有限公司，FISH检测所用产前诊断探针试剂盒购自北京金菩嘉。染色体核型分析按行业标准进行，至少计数20个细胞并分析5个分裂相。FISH检测探针为GLP 13/21和CSP 18/X/Y两组，每组探针至少计数50个细胞。CMA采用Affymetrix公司CytoScan 750k进行全基因组范围扫描，按配套检测试剂盒及优化的标准流程进行，检测仪器为Affymetrix GeneChip System 3000Dx v.2芯片系统，分析软件为Affymetrix Chromosome Analysis Suite Software(version:4.0.1252)。所有检查项目孕妇均签署知情同意书。

1.2.4 外周血染色体核型分析 NIPT低风险但新生儿疑为筛查目标疾病的，进行外周血染色体核型分析。常规方法制备染色体并进行G显带。核型分析时每例计数20个分裂相，分析3～5个染色体核型；若发现染色体异常时，计数分裂相不少于50个，分析5～10个染色体核型。所用培养基为HyClone RPMI Mediun Modified，小牛血清为Gibco Newborn Calf Serum，PHA购自上海新国卫医疗器械有限公司。

1.2.5 拷贝数变异的高通量测序分析 引产胎儿组织及胎盘、脐带组织采用Illumina 550基因测序仪进行拷贝数变异检测。用组织提取试剂盒(德国QIAGEN)提取基因组DNA，随机打断，末端修复，加A连接进行文库构建，对测序数据进行生物信息分析。

1.2.6 随访 对所有的NIPT高风险进行随访，所有低风险孕妇在新生儿出生后进行随访。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件，数据采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 孕妇分组概况 11501例孕妇按临床指征分组(表1)：(1)血清学筛查T21高风险组，2368例(20.59%)；(2)血清学筛查T18高风险组，247例(2.15%)；(3)血清学筛查T21临界风险组，2366例(20.57%)；(4)高龄组，3986例(34.66%)；(5)NT增厚组，185例(1.61%)；(6)其它超声软指标异常组，300例(2.61%)；(7)无指征组，2049例(17.82%)。各组占比由高到低依次为④>①>③>⑦>⑥>②>⑤。

表1 不同组别NIPT筛查指标统计分析

2.2 NIPT在11501例孕妇中总体筛查效率和发病率的统计分析 如表1所示，11501例孕妇中，NIPT高风险共138例，假阳性14例，假阴性3例，筛查敏感度97.64%，特异度为99.88%，复合PPV为89.86%，总发病率为1.10%。如表2所示，尽管NIPT针对T18、T13的筛查敏感度(均为100%)优于T21(96.84%)，但二者的PPV(83.87%、54.55%)明显低于T21(95.83%)。T21、T18、T13的发病率分别为0.83%、0.23%、0.05%(表2)，两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 各组孕妇中NIPT筛查效率比较 不同临床指征组NIPT总体筛查指标如下(表1)：(1)筛查敏感度：血清学筛查①～③组和⑥组均为100%，⑤组最低为88.89%；(2)筛查特异度：各组间差异不大，④组最低为99.80%；(3)PPV：②、⑤、⑥组均为100%，③组最低为71.43%。NIPT筛查效率组间综合比较如下：②=⑥>①>③>④>⑤>⑦。

2.4 各组孕妇中目标疾病发病率的比较 不同组别发病率差异较大。如表1所示：①组(1.69%)、④组(1.28%)、⑥组(1.33%)间差异无统计学意义(P>0.05)，但均显著低于②组(3.64%)和⑤组(4.86%)(P<0.05)，显著高于③组(0.21%)和⑦组(0.44%)(P<0.05)。各组发病率比较：⑤>②>①>⑥>④>⑦>③。按疾病统计(表2)，T21发病率以⑤组(3.24%)最高，②组中未发现T21病例；T18发病率以②组(2.43%)最高，③组(0.04%)最低；T13发病率以②组(1.21%)最高，③～⑥组无真阳性病例。

表2 NIPT针对不同目标疾病筛查指标统计

2.5 不同临界风险亚区间孕妇发病率的分析比较 随着风险值降低，连续的4个临界风险区间(1/270>风险值≥1/350、1/350>风险值≥1/500、1/500>风险值≥1/750、1/750>风险值≥1/1000)总体发病率依次为0.54%、0.16%、0.17%、0.13%，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表3 不同临界风险区间NIPT筛查指标统计

2.6 NIPT低风险孕妇随访情况 共发现3例假阴性，高龄组、无指征组、NT增厚组各1例(表4)。第2例为无指征组，自愿选择进行NIPT检测，后因胎儿超声提示异常(颈部皮下软组织增厚8mm，室间隔缺损，主动脉骑跨)引产，取胎儿组织行CMA检测诊断为21三体；另2例21三体患儿均为出生后外周血染色体核型确诊。

表4 NIPT假阴性病例

2.7 T18假阳性病例胎盘、脐带行拷贝数变异检测 高龄组中，1例T18假阳性胎儿足月娩出后留取脐带及胎盘，多点取样检测发现胎盘脐带远端、子面右侧、边缘下/左为整倍体，而脐带近端、胎盘子面左侧、边缘上为T18的高比例嵌合(70%)，胎盘母面左/右侧、边缘右侧为T18的低比例嵌合(15%)。

3 讨 论

尽管NIPT技术给产前筛查-产前诊断工作体系带来了巨大变革[9]，但其应用仍存在适应证把握不严格、临床指征混乱的现象以及“NIPT等同于产前诊断”的思想误区，具有较大安全隐患，因此如何针对特定孕妇群体进行准确遗传咨询是临床工作亟待解决的问题。本研究纳入的11501例孕妇，近60%为NIPT慎用人群，包含了血清学筛查高风险、高龄及胎儿超声软指标异常孕妇，能很好地反映临床现状；研究设计上，分组较以往文献更加详细，将血清学筛查高风险和超声软指标异常孕妇进一步分类比较；研究数据分析上，不仅对NIPT整体筛查效率进行了评估，也比较了不同临床指征组的筛查效率，并结合目标疾病发病率进行了分析。本研究结果可为不同指征孕妇的遗传咨询和临床管理提供理论依据。

由于存在方法学的局限性及诸多影响因素，如胎儿游离DNA浓度过低、胎儿与胎盘核型不一致、限制性胎盘嵌合、母源性基因组拷贝数变异的干扰等[10]，NIPT针对目标疾病的敏感度、特异度和PPV会有所降低。本研究结果显示，NIPT针对目标疾病总的筛查敏感度为97.64%，特异度为99.88%，复合PPV为89.86%，远高于国卫办妇幼发[2016]45号文中的质量控制指标，取得了较好的筛查效果；按单项疾病统计，NIPT针对T18和T13的敏感度均为100%，T21略低(96.84%)，而T21的PPV(95.83%)明显高于T18(83.87%)和T13(54.55%)，与文献报道一致[11]。但在临床工作中，因NIPT高风险直接将胎儿引产的情况时有发生，当结果提示目标疾病尤其是T18和T13高风险时，临床医师应尽可能引导孕妇进行介入性产前诊断，以排除假阳性。

自2016年二孩政策放开以来，高龄孕妇占比明显增高。本研究中高龄组占比最高(34.66%)，国外一项10万例数据的NIPT报道中显示高龄孕妇占比高达59.7%[5]，如何对该类孕妇有效监管是临床工作的重中之重。研究显示，高龄妊娠时染色体异常发生风险大大增加，30岁以下女性囊胚的整倍体率为70%，至37岁降至50%，而超过43岁降至15%[12]；高龄妊娠时卵子质量变差，非整倍体胚胎发生率的上升会增加“三体自救”的频率，从而提高限制性胎盘嵌合发生的概率，而NIPT检测的胎儿DNA主要来自胎盘凋亡细胞，这就提高了假阳性出现的概率。本研究数据显示，高龄组T18假阳性病例与限制性胎盘嵌合有关，因此针对高龄孕妇进行检测前遗传咨询时应强调NIPT方法学的局限性，同时鼓励高风险孕妇行产前诊断以排除假阳性。

研究显示，除筛查技术本身的局限性外，NIPT的筛查效率还在一定程度上取决于是作为一线筛查还是基于血清学筛查的二线筛查手段[3-4,13-14]。本研究中无指征组筛查效率在所有组别中最差，与文献中结论相同，对于这部分孕妇在NIPT检测前临床咨询时应格外谨慎，因目标疾病发病率较低，还需更大样本研究数据的支持。

关于不同临床指征孕妇NIPT的筛查效率，各文献报道不一。范向群等[11]对11133例孕妇研究发现，血清学筛查高风险组中NIPT结果与产前诊断结果一致性最好，其次为高龄组和临界风险组，与本研究结论一致。而张玢等[7]对10275例孕妇的检测显示，NIPT对高龄孕妇的筛查效率最高，而对血清学筛查高风险孕妇的筛查效率略低，其次为临界风险孕妇，这可能与样本量、检测孕妇群体不同有关。

血清学筛查高风险孕妇行NIPT是普遍现象，文献中报道最多[15-17]，但均未对此类孕妇进一步分类统计[5,7,11]。本研究数据分析发现，血清学筛查T18高风险组中T18和T13筛查效率较好，未发现T21病例；血清学筛查T21高风险组中T21和T13的筛查效率较好，T18的筛查效率较差。综上所述，尽管血清学筛查高风险组中NIPT作为二线筛查的效果比较满意，但当血清学筛查T21高风险而NIPT提示T18高风险时应警惕假阳性。

国内常用的中孕期三联血清学筛查漏掉约30%的患儿[18]，多数假阴性位于临界风险区间，但该风险范围报道不一，以1/270～1/1000的划分最多[19-21]。陈怡博等[22]发现，8397例临界风险(1/270～1/1000)孕妇中胎儿T21的发病率(0.73‰)显著低于高风险孕妇(6.22‰)，显著高于风险值小于1/1000的孕妇(0.04‰)。郑文吉等[23]回顾分析了14例假阴性病例，其中有10例(71.43%)风险值在1/270～1/1000区间，另4例(28.57%)风险值小于1/1000。研究均提示，加强临界风险孕妇的管理，对于提高目标疾病的检出率具有重要意义。45号文将1/270～1/1000风险区间的孕妇作为NIPT适用人群，再次说明其重要性，但若能在兼顾检出率的同时相对缩小临界风险的范围，将会实现筛查经济效益的最大化。基于此，本研究参考以往报道[22]，在1/270～1/1000区间增加了1/350、1/500、1/750共3个候选截断值，分析发现随风险值降低,4个连续区间的目标疾病发病率逐渐下降，以1/270～1/350发病率最高(0.54%)，另三个区间发病率明显降低，但仍高于陈怡博等[22]统计的1/270～1/500、1/500～1/750、1/750～1/1000三个区间发病率(0.8‰、0.77‰、0.65‰)，这可能与实验方案有关，该研究中只统计了T21病例，未包含T13和T18病例，且所有病例均为出生后随访发现，极可能漏掉了在孕期因胎儿畸形流产未明确遗传病因的病例。本研究与之相比，亚区间划分更细，初步结果显示以1/270～1/350区间发病率最高，因此该区间筛查的经济效益最高，但不同区间发病率无统计学差异，仍需加大样本研究。值得注意的是，将NIPT作为临界风险孕妇的二级筛查手段，不易漏检阳性病例，所统计的目标疾病发病率更接近真实水平，可为遗传咨询提供参考。

NT是临床常用的超声软指标，国内通常以2.5mm作为增厚的判断标准，国外为3.0mm[24]。以往有关NIPT在超声软指标异常的孕妇中的应用报道较少，均为小样本数据，阳性率一般为1%～11%[7-8,25-26]，且多数未对NT增厚孕妇单独统计。本研究中的NT增厚组测值多为3.0mm以内，所有组中发病率最高(4.86%)，但敏感度最差仅为88.89%。有研究数据显示，胎儿染色体异常发病率随NT厚度增加而显著提高，NT为2.5～2.9mm时仅为1.4%，而NT≥6mm时可达44.1%[27]，因此针对NT增厚组孕妇进行遗传咨询时应强调染色体疾病的高发病率及NIPT技术的局限性，尽量引导孕妇进行产前诊断，以提高阳性检出率。

综上所述，NIPT总体筛查效果较好，但该技术针对不同临床指征组孕妇的筛查效率及同一组中不同目标疾病的筛查效率均有所不同。筛查效率以血清学筛查T18高风险组和其它超声软指标异常组最高，无指征组最低；筛查敏感度以T18和T13的最高，PPV以T21最高；发病率以NT增厚组最高，血清学筛查T21临界风险组最低。临床咨询时，医师应结合NIPT的筛查效率与目标疾病的发病率给出合理建议，后续应重点关注发病率高而筛查效率低的孕妇群体，假阳性、假阴性病例发生机制的研究对于提高NIPT筛查效率具有重要意义。