单囊胚移植策略对冻融周期临床结局的影响

李昕妍，柴三明，李甫云，王琰，王志强，张霖，晏博，杨金伟，倪亚莉

(甘肃省妇幼保健院生殖医学中心，兰州 730050)

近年来辅助生殖技术飞速发展，为了提高临床妊娠率，有些中心采取多胚胎移植，一定程度上导致多胎妊娠率增加。研究显示，辅助生殖技术助孕后的多胎妊娠率高达25%～30%[1]。多胎妊娠率的逐年上升已成为早产、流产、围产儿发病率和死亡率增加以及妊娠期高血压及前置胎盘等并发症增加的重要原因。多胎妊娠不但危害母儿健康，而且为患者自身及社会增加经济负担[2-3]。在体外受精过程中，根据胚胎发育天数不同分为卵裂期胚胎和囊胚。从卵裂期胚胎发育到囊胚，经过了初步淘汰，囊胚移植后妊娠结局较卵裂期移植有一定提高，且单囊胚移植也降低了多胎妊娠率。如何更好的应用单囊胚移植，提高妊娠结局，是生殖医生关注的热点问题。由于形态学评估参数及冷冻解冻策略存在差异，目前单囊胚移植还未形成共识[4]。因此，本研究旨在探讨单囊胚移植冷冻、解冻策略及胚胎学评估参数中对冻融胚胎临床结局的主要影响因素，探索囊胚冷冻、解冻及移植的最佳策略。

资料与方法

一、研究对象及分组

回顾性分析2016年1月至2020年10月期间在甘肃省妇幼保健院生殖中心接受冻融周期单囊胚移植患者的周期资料，所有囊胚采用玻璃化冷冻复苏法进行冷冻、复苏。纳入标准：(1)冻融周期为激素替代周期内膜准备方案；(2)囊胚为D5或D6的单囊胚，扩张程度在3期以上；(3)解冻后存活且扩张程度达1/2以上的囊胚；(4)排除胚胎植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing，PGT)周期。

共纳入979个周期，分别按照发育天数、内细胞团(ICM)评分、滋养层细胞(TE)评分级别和解冻后体外培养时间进行分组比较。按照发育天数分为D5组(n=520)和D6组(n=459)；按照囊胚ICM评分不同分为A1组(ICM细胞数目多，排列紧密，n=54)、B1组(细胞数目少，排列松散，n=526)和C1组(细胞数目很少，n=399)；按照TE评分不同分为A2组(上皮细胞层由较多的细胞组成，结构致密，n=58)、B2组(上皮细胞层由不多的细胞组成，结构松散，n=759)和C2组(上皮细胞层由稀疏的细胞组成，n=162)；按照解冻后体外培养时间分为D5解冻后培养2～4 h组(n=320)、D5解冻后培养16～20 h组(n=200)、D6解冻后培养2～4 h组(n=182)和D6解冻后培养16～20 h组(n=277)。

二、研究方法

1.囊胚冷冻与解冻：囊胚冷冻与解冻分别采用玻璃化冷冻、解冻方法，冷冻使用Itrification Kit试剂盒(Kitazato公司，日本)，解冻使用Thawing Kit试剂盒(Kitazato公司，日本)，按照试剂盒操作说明进行操作。囊胚冷冻前应先行人工皱缩，冷冻D5或D6 级别为3BC/3CB及以上的可利用囊胚。

2.囊胚评分：使用Gardner评分系统，根据囊胚腔的大小和是否孵出将囊胚分为6个时期，对于处于3至多期的囊胚，还需对其ICM和TE进行质量分级，以便对囊胚的状况进行较全面的评定。

3.激素替代周期准备内膜：于月经周期第2天起使用雌激素(芬吗通，苏威制药，荷兰)，3 mg每日两次，7 d后每3～5 d行B超监测内膜厚度，用药10～12 d当内膜厚度≥8 mm时加用孕激素(黄体酮注射液，浙江仙琚)使内膜转化为分泌期。转化前需评估内膜厚度、形态、抽血测激素水平。应用黄体酮3～5 d后解冻行囊胚移植，并持续黄体支持。

4.分类决策树模型：采用SPSS 23.0卡方自动交互检验(CHAID)，指定项：以是否妊娠为因变量，以发育天数、ICM、TE和解冻后体外培养时间为自变量，年龄为影响变量来建立模型。

三、统计学分析

结 果

一、D5和D6冻融周期单囊胚移植临床结局比较

本研究共纳入979个周期的患者资料，其中D5囊胚组520例，D6囊胚组459例。两组间患者年龄、不孕类型、内膜厚度及内膜类型均无显著差异(P>0.05)，D5组临床妊娠率显著高于D6组(P<0.05)(表1)。

表1 D5与D6囊胚移植患者一般情况及临床妊娠结局比较[(-±s)，n(%)]

二、不同ICM级别对临床结局的影响

ICM级别不同的3组患者间年龄具有显著差异(P<0.05)，经LSD进一步统计分析，细胞数目很少的C1组患者年龄显著高于其他两组(P<0.05)；不孕类型、内膜厚度及内膜类型在3组间均无显著差异(P>0.05)；A1、B1、C1组的临床妊娠率呈逐渐下降趋势，两两比较均具有显著差异(P<0.05)(表2)。

表2 ICM评分不同的患者一般情况及临床妊娠结局比较[(-±s)，n(%)]

三、不同TE级别对临床结局的影响

TE评分不同的3组患者间年龄、不孕类型、内膜厚度及内膜类型均无显著差异(P>0.05)；A2、B2、C2组的临床妊娠率呈逐渐下降趋势，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表3 TE细胞评分不同的患者一般情况及临床妊娠结局比较[(-±s)，n(%)]

四、囊胚解冻后不同培养时间对妊娠结局的影响

D5囊胚解冻后不同培养时间组间年龄、内膜类型均无显著差异(P>0.05)，不孕类型及内膜厚度有显著差异(P<0.05)，解冻后培养2～4 h组的临床妊娠率显著高于16～20 h组(P<0.05)；D6囊胚解冻后不同培养时间组间年龄、内膜厚度、内膜类型均无显著差异(P>0.05)，不孕类型存在显著性差异，同样解冻后培养2～4 h组的临床妊娠率显著高于16～20 h组(P<0.05)(表4)。

表4 囊胚解冻后不同体外培养时间组间的一般情况及临床妊娠结局比较[(-±s)，n(%)]

五、临床妊娠率多因素分析

经Logistic分析得出，女方年龄、ICM评分、TE评分、发育天数与临床妊娠率呈负相关(P<0.05)，解冻后培养2～4 h与临床妊娠率呈正相关(P<0.05)(表5)。

表5 妊娠结局多因素分析

六、分类决策树模型结果

模型中纳入体外发育天数、解冻后体外培养时间、ICM及TE评分为自变量，结果表明决策树分2层，共生成4个节点：第一层为ICM级别(A、B级 vs. C级，P=0.000，χ2=49.438)，第二层为解冻后培养时间(培养16～20 h vs.培养2～4 h，P=0.011，χ2=6.502)，交叉验证正确百分比为35.8%(图1)。

Adj：调整后统计值；n：周期数；节点1为ICM评分A或B级囊胚，节点2为ICM评分C级囊胚，节点3和4为节点1的子节点，分别表示解冻后2～4 h和解冻后16～20 h图1 分类决策树

讨 论

囊胚大多在胚胎发育至第5天和第6天形成，国内外很多学者就胚胎发育天数对妊娠结局的影响进行了研究，但仍存在很大争议[5-6]。漆倩荣等[7]认为冻融周期D6囊胚移植可达到和D5囊胚相近的妊娠结局，就冻融周期而言，发育天数对妊娠结局无显著影响。本研究比较了D5囊胚和D6囊胚的妊娠结局，发现D5囊胚组的妊娠率明显高于D6囊胚组，Logistic回归分析显示发育天数与临床妊娠率有相关性，这与Elgindy等[8]的研究结果一致，可能是由于D6囊胚的异常纺锤体发生率高于D5囊胚，其非整倍体率增高[9]，从而导致D6囊胚临床妊娠率低于D5囊胚。另外D6囊胚较D5囊胚发育迟缓，在体外培养时间较长，可能导致DNA损伤，后续发育潜能下降[10]。

在囊胚移植过程中，选择发育潜能好的囊胚是获得更好的临床结局的关键因素。在移植周期中，囊胚质量是首要考虑的因素。目前形态学评分仍为评价胚胎质量的主要方法，囊胚形态学评分通常使用Gardner评分体系[11]。在胚胎发育过程中，随着囊胚的形成分化成两个具有明显差异的细胞群ICM和TE。Gardner评分体系主要以囊胚扩张程度、ICM和TE级别做为评价指标，多种影响因素增加了胚胎实验室挑选胚胎的难度。

本研究发现ICM级别不同的3组患者间年龄和临床妊娠率具有显著差异(P<0.05)。ICM级别A、B两组的患者年龄均小于C组，而妊娠率均高于C组。Logistic分析结果显示，ICM级别低是影响临床妊娠率的危险因素，并且分类决策树第一层为ICM级别，ICM级别 A、B级与C级比较临床妊娠率有显著性差异(P<0.05)。因此，在单囊胚移植时我们应该首先考虑ICM级别。国内也有研究表明，在囊胚发育天数、ICM评分与TE评分这3个变量中，仅ICM评分对临床结局有影响，因此ICM是决定囊胚发育潜能的主要因素[12]。

关于ICM和TE对于临床结局的相对影响，目前仍然尚未定论。Thompson等[13]认为TE的级别和患者年龄是影响临床结局重要的独立预测因素。国内学者陈清汾等[14]亦发现，对于非优质囊胚而言，TE评分低者，临床妊娠率降低、流产率升高。在本研究中TE级别不同的3组患者间临床妊娠率具有显著差异(P<0.05)。Logistic分析结果显示，TE级别是影响临床妊娠率的危险因素，但是分类决策树指定项中加入TE为自变量，结果中没有TE这一节点，这可能是由于本研究中TE级别大多为B级[占总数的77.53%(759/979)]所导致。并且张亚楠等[15]发现囊胚ICM及TE评级与活产率呈负相关，在行冻融周期单囊胚移植时，为获得较好的临床结局，应挑选ICM与TE评分较高的囊胚。位于囊胚内部的ICM保持多能性，随后发育为卵黄囊和胚体；位于囊胚外部的细胞分化为TE，增殖后发育成胎盘等外胚器官，利于着床。ICM后期发育为胎儿本身，但如果没有功能性TE建立的着床，后期在母体内的生长就很难发生，挑选胚胎时就有一定的难度[16]。因此，在单囊胚移植时应该按照分类决策树提供的参考排除ICM为C级的囊胚，首先挑选ICM级别高的囊胚，再选择TE级别高的囊胚。

目前玻璃化冷冻技术应用广泛，各中心解冻策略也有所不同。有的中心解冻后2～4 h 移植，有的中心则提前解冻后培养16～20 h移植。Fang等[17]认为解冻后培养时间对妊娠结局无明显影响。而习海涛等[18]的研究中，解冻后培养16～20 h的囊胚孵化率高达86.5%，而解冻后4 h 的囊胚孵化率仅有41.8%。有研究认为已经孵化好的比正在孵化的囊胚具有更好的发育潜能并且可以获得更好的临床结局[19]。这可能与解冻后培养16～20 h后会淘汰一部分发育潜能不良、趋向凋亡的囊胚有关。

本研究结果显示，囊胚解冻后2～4 h 移植的临床妊娠率显著高于囊胚解冻后培养16～20 h移植。Logistic回归分析显示，解冻后体外培养时间是影响妊娠率的重要因素，并且分类决策树显示ICM级别为A、B级的囊胚解冻后2～4 h 移植的临床妊娠率显著高于解冻后培养16～20 h组(P<0.05)。因此D5囊胚和D6囊胚解冻后当天移植较解冻后培养16～20 h移植的临床结局有所改善。刘军霞等[20]也认为D5冷冻囊胚解冻后2～4 h 移植的临床结局优于解冻后16～20 h 移植，这可能与囊胚解冻后培养16～20 h再移植，体外培养时间过长增加了囊胚损伤的可能性有关[21]。因此，建议解冻后培养时间不宜过长。有文献报道D6囊胚解冻后16～20 h 移植妊娠率低的原因可能是由于囊胚在体外培养天数延长，导致促凋亡基因BAX表达增加，从而增加了凋亡的风险[22]。

朱序理等[23]运用分类决策树模型选择冻融周期胚胎移植，交叉验证正确百分比为57.8%，而本研究中分类决策树模型交叉验证正确率仅为35.8%，可能与模型中纳入的自变量较多有关。并且胚胎移植后临床结局影响因素较多，女性年龄、内膜厚度、不孕年限、不孕原因、患者子宫内环境、机体免疫状态、移植过程等均可对胚胎移植后临床结局产生影响。通过本模型的分析，可以利用胚胎形态学主要参数选择最佳单囊胚移植策略，但还具有一定的局限性。

本研究所涉及的研究对象为冻融周期单囊胚移植，排除移植胚胎数目对临床结局的影响，并且采用激素替代周期，排除了新鲜周期不同促排卵方案对子宫内膜容受性的影响，以尽量减少组间混杂因素对妊娠结局的影响。为了排除年龄对后续结果的影响，将其纳入自变量进行二分类Logistic回归分析，结果显示女方年龄、囊胚体外发育时间、ICM及TE评级和解冻后体外培养时间对冻融周期单囊胚移植的临床结局都有一定的影响。本研究中分类决策树模型交叉验证正确百分比低于50%，主要是因为影响临床结局的因素不仅仅是囊胚质量和发育速度，还有其他很多因素。

本研究仍存在局限性。首先，样本量较少，还需扩大样本量进一步研究；其次，囊胚形态学评分受主观因素影响较大，不同操作者评分可能存在一定差异，并且在本研究中ICM多为B、C级，TE多为B级，因此结果可能存在偏倚，有待进一步观察；第三，临床妊娠结局受多种因素的影响，本研究纳入的自变量较少，未将患者的不孕年限、囊胚冻存时间、受精方式、体质量指数(BMI)、活产率等纳入研究，以探究可能的影响因素，以便选择最佳的单囊胚移植策略提高临床妊娠率。

综上所述，建议囊胚解冻后2～4 h 移植，在挑选单囊胚时，建议根据ICM级别优先选择ICM评分为A、B级的D5囊胚，再根据TE级别选择TE评分为A、B级的囊胚。